Перенос генетической информации в клетку реципиента осуществля-
ется в составе вектора. Вектор – это, как правило, кольцевая молекула
ДНК, способная к самостоятельной репликации. Ген вместе с вектором
Образует рекомбинантную ДНК.
Конструирование рекомбинантных ДНК
При обычном введении в бактериальную клетку ДНК подвергается
Ферментативной атаке, в результате которой разрушается. Чтобы этого не
Происходило, используют векторные молекулы ДНК, способные при вве-
дении в клетку существовать автономно, а при делениях клетки – репли-
Цироваться. Вектор также несет в своем составе генетический признак,
Необходимый для последующего распознавания и отбора трансгенных
Организмов. Обычно в качестве маркерных генов используют гены устой-
Чивости к антибиотикам.
Конструирование рекомбинантных ДНК осуществляется in vitro с изо-
Лированными ДНК при помощи эндонуклеаз рестрикции, которые расще-
Пляют вектор в одном участке, превращая его из кольцевой формы в ли-
Нейную с образованием липких концов, комплиментарных концам вводи-
Мой ДНК. Комплиментарные концы вектора и вводимого гена сшиваются
Лигазой. Полученную рекомбинантную ДНК с помощью той же ДНК-
Лигазы замыкают с образованием кольцевой молекулы.
В качестве векторов используют плазмиды и вирусы. Вирусы быстро
Транспортируются из клетки в клетку, за короткое время способны быстро
Заразить весь организм. Важной проблемой при их использовании являет-
ся аттеньюация – ослабление патогенности для хозяина; таким образом, не
Очевидно, что зараженные вирусом клетки выживут и смогут передавать
Потомству измененную генетическую программу. Наиболее распростра-
Ненными векторами являются многокопийные плазмиды с молекулярной
массой 3–10 кб. Первые плазмиды были выделены из бактерий, впослед-
Ствии их стали конструировать методами генной инженерии.
Использование векторов общего назначения методически – несложная
Задача, не требующая специального оборудования. Наиболее используе-
Мыми плазмидными векторами для клонирования являются плазмиды E.
Coli (pBR322, pBR325, pACYC117, pACYC 184), а также сконструирован-
Ные на основе плазмиды CoIEI. Современные плазмидные векторы в при-
Сутствии хлорамфеникола способны к репликации, независимо от деления
хромосомы, количество копий плазмид при этом может возрастать до 1–
Копий на клетку.
При получении библиотеки генов растений и высших животных, у ко-
торых общая длина генома составляет до 3⋅109 и более, емкость вектора
Часто играет решающую роль. В данном случае в качестве вектора ис-
пользуют ДНК фага λ. При помощи специальных методов рекомбинант-
Ные ДНК вводят прямо в фаговые головки. Еще большей емкостью обла-
дают плазмиды – космиды (до 40 кб), у которых cos-фрагмент генома фага
λ, участвует в упаковке ДНК в фаговую частицу на конечной стадии раз-
Вития. Для упаковки ДНК необходимо, чтобы ДНК содержала COS-
Участок и ее размер был примерно равным размеру генома ага l. Достиг-
Нутые методы упаковки ДНК в фаговую головку при помощи космид по-
Зволяют получать библиотеки генов практически любых организмов.
Перенос генов в клетки организма-реципиента
Перенос рекомбинантных ДНК осуществляется путем трансформа-
ции или конъюгации. Трансформация – это процесс изменения генетиче-
Ских свойств клетки в результате проникновения в нее чужеродной ДНК.
Впервые она была обнаружена у пневмококков Ф. Гиффитом, который
Показал, что некоторые клетки невирулентных штаммов бактерий при
Заражении ими мышей совместно с вирулентными штаммами приобрета-
Ют патогенные свойства. В дальнейшем трансформация была продемонст-
Рирована и изучена у различных видов бактерий.
Установлено, что к трансформации способны лишь некоторые, так
называемые «компетентные», клетки (способные включать чужеродную