Процессы биотехнологических производств

Кафедра микробиологии и биохимии

Методические указания

К выполнению контрольной работы

по теме: «Основные этапы биотехнологических производств»

По дисциплине: Введение в биотехнологию

для направления 020200.62 «Биология»

Форма обучения: очная

Мурманск

Составитель – Елена Викторовна Макаревич, канд. биолог. наук, профессор кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета

Методические указания к выполнению контрольных работ рассмотрены и одобрены на заседании кафедры-разработчика «____»_________________2013 г., протокол № _____.

Рецензент – Ольга Юрьевна Богданова, канд. биол. наук, профессор кафедры микробиологии и биохимии Мурманского государственного технического университета

СОДЕРЖАНИЕ

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ………………………………………………………..…4

2. Методические указания к выполнению контрольной работы…………………………………………………………………………..….5

3. Вопросы для самопроверки…………………………………………....9

4. Тестовые задания……………………………………………………..…..10

5. Практические задания………………………………………………..…20

6. Рекомендуемая литература………………………..……………..…..21

1. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Контрольная работа представляет собой одну из форм текущего контроля знаний студентов, и его выполнение является обязательным для всех студентов. Если работа не зачтена, студент должен иметь возможность ее исправить, путем повторного выполнения контрольной работы. Студенты, не выполнившие контрольную работу, к экзамену не допускаются.

Целью выполнения контрольной работы является углубление и закрепление знаний студентов, полученных при теоретическом изучении дисциплины и позволяет студенту продемонстрировать знания и навыки, приобретенные за время обучения по теории, а также возможность их применения в практической деятельности.

Студенты выполняют контрольную работу в сроки, установленные графиком. Выполнение контрольной работы является завершающим этапом в изучении отдельных тем дисциплины «Введение в биотехнологию».

Методические указания к выполнению контрольной работы

на тему «Основные этапы биотехнологических производств».

Для выполнения контрольной работы необходимо:

1. Изучить теоретические данные по курсу;

2. Ознакомиться с рекомендуемой литературой;

3. Ответить на вопросы по данной теме;

4. Решить предоставленные в методическом пособии тестовые задания;

5. Составить технологическую схему получения биомассы микроорганизмов.

ПРОЦЕССЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Процессы биотехнологических производств разнообразны, но все они имеют пять общих основных стадий, которые могут различаться в зависимости от целевого продукта и способа его получения. Основные стадии следующие: приготовление питательной среды; получение посевного материала; культивирование микроорганизмов; выделение целевого продукта; очистка целевого продукта. Общая биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза приведена на рис. 1.1.

Приготовление питательной среды

Задача специалиста, оптимизирующего состав среды для конкретного вида микроорганизма, - выбрать такие источники углерода, азота, фосфора и других веществ, которые наиболее оправданы в экономическом и экологическом отношениях.

Принцип составления питательных сред. Каждый конкретный вид микроорганизмов, используемых в биотехнологии, строго избирателен к питательным веществам. Потребность микроорганизма в тех или иных соединениях определяется физиологическими особенностями данного вида микроба, но во всех случаях среда должна быть водным раствором этих веществ и обеспечивать в определенном количестве их приток в клетку.

В самом приближенном виде физиологические потребности микроорганизма в питательных веществах можно выявить, определив химический состав микробной клетки. Однако в этом случае не учитываются количество и состав метаболитов, удаленных клеткой во внешнюю среду, и то обстоятельство, что состав клеточного вещества микроорганизма зависит от состава среды обитания и варьирует в достаточно широких пределах. Но все же, первоначальную ориентировку в выборе оптимального состава питательной среды, исходя из состава клеточного вещества микроба, сделать можно.

Важнейшим условием приготовления питательных сред является соблюдение правиласептики. Для обеззараживания питательных сред применяют, как известно, химическое воздействие (дезинфекцию), воздействие температуры и других физических факторов (ультразвука, ультрафиолетовых лучей, ультрафильтрации). Каждый из этих методов весьма избирателен. В биотехнологии широко применяют термические методы обеззараживания питательных сред (автоклавирование, стерилизацию, кипячение и др.). Споры микроорганизмов более устойчивы к высокой температуре, поэтому именно споры бактерий являются лимитирующим фактором, определяющим температурные режимы стерилизации сред.

Для стерилизации воздуха в случае аэробных процессов культивирования используют фильтрование и ультрафиолетовое облучение.

Продуцент		Подготовка посевного материала		Питательная среда
		Культивирование
		Разделение
Культуральная жидкость				Клетки
		Биомасса убитых клеток		Биомасса живых клеток
Дезинтеграция убитых клеток
Выделение и очистка метаболитов
Концентри-рование		Концентри- рование		Концентри- рование
Стабилизация продукта		Стабилизация продукта		Стабилизация продукта
Обезвоживание		Обезвоживание		Обезвоживание

Сухой продукт

Жидкий продукт

Сухой продукт

Жидкий продукт

Сухой продукт

Жидкий продукт

Хранение

Применение

Рис. 1.1. Принципиальная биотехнологическая схема производства

продуктов микробного синтеза

Получение посевного материала

Поддержание чистой культуры штамма-продуцента - ключевая задача любого биотехнологического производства. Культуры микроорганизмов-продуцентов заводы получают из коллекций в пробирках на агаризованных питательных средах или в ампулах. Чистая культура микроорганизма может постоянно или по мере необходимости использоваться в производстве. При длительном хранении чистых культур могут происходить случайные нерегулируемые мутации. Для избежания мутаций следует не только соблюдать правила хранения и поддержания исходной культуры, но и периодически проводить пересев культуры и проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам.

Посевным материалом (инокулятом) называют чистую культуру микроорганизма, которую получают путем ее последовательного пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема до количества, необходимого для промышленного производства. Сначала чистую культуру размножают в лаборатории, затем в цехе чистых культур и инокуляции, далее направляют на культивирование. Приготовление посевного материала состоит из следующих стадий:

1. Получение культуры микроорганизма в микробиологической лаборатории завода.

2. Выращивание микроорганизмов в малом посевном аппарате.

3. Выращивание микроорганизмов в большом посевном аппарате.

4. Накопление культуры микроорганизмов в малом ферментере.

Передачу чистых культур из одного аппарата в другой осуществляют в конце логарифмической фазы роста. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.

В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты (грамположительные бактерии, не образующие спор), бактерии и водоросли в виде чистых и смешанных культур. В традиционных процессах ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам, а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам (чистым культурам), выращиваемых в асептических условиях. Большинство используемых сегодня культур получено из природных источников, однако затем эти культуры были улучшены или путем выращивания в условиях, характерных для данного процесса (для повышения выхода биомассы и первичных метаболитов), или с помощью мутагенеза или генетической инженерии (для производства вторичных метаболитов).

Ферментация (культивирование)

Это самый важный и продолжительный этап биотехнологического производства. Ферментация представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпывания питательных веществ среды. Существует два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение ценных веществ (метаболитов), возникающих в ходе роста или на последующих стадиях развития культуры.

Как говорилось ранее (п. 2.1), для выращивания любой культуры необходимы: жизнеспособный посевной материал; источники энергии и углерода; питательные вещества для синтеза биомассы; отсутствие ингибиторов роста; соответствующие физико-химические условия.

На оптимальной питательной среде при благоприятных значениях рН и температуры, при условии подачи требуемого количества воздуха в среду микроорганизмы быстро начинают расти и размножаться, обеспечивая накопление биомассы продуцента и биологически ценных метаболитов в культуральной жидкости. Для культивирования микроорганизмов в промышленных масштабах применяют ферментеры (или ферментаторы) – реакционные емкости, в которых при определенных условиях находятся микроорганизмы. Основное назначение ферментатора – своевременно обеспечить микробные клетки необходимыми питательными веществами и кислородом (при необходимости) и отвести продукты обмена веществ, создать однородный состав среды при условии слабого потока культуральной жидкости (при непрерывном культивировании). Для поддержания кислородного режима ферментатор снабжается устройством подвода воздуха, для лучшего перемешивания среды – мешалками различной конструкции. Для поддержания температуры среды предусмотрены системы охлаждения.

Выделение целевого продукта

Стадия выделения продукта существенно зависит от того, накапливается продукт в клетках или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Разделение биомассы и культуральной жидкости - сепарация - осуществляется несколькими методами.

Если целевым продуктом является биомасса клеток, применяют следующие методы выделения: отстаивание, фильтрация, флотирование, сепарирование и т.д. (механические способы); выпаривание и сушка (физические способы).

Фильтрация– простой и широко применяемый процесс разделения твердых частиц и жидкости, скорость которого зависит от пористости фильтрующего материала и давления. Фильтрование при помощи вакуумных насосов существенно ускоряет процесс.

Флотирование применимо для выделения дрожжевых клеток. Процесс флотирования клеток осуществляется путем вспенивания культуральной жидкости. Вместе с пеной из культуральной жидкости удаляется и основная масса дрожжей.

Сепарирование осуществляют в сепараторах, в которых на клетки действует центробежная сила, отбрасывающая клетки к периферии сосуда, а культуральная жидкость будет собираться в центре сепаратора. Этот процесс протекает гораздо быстрее, чем отстаивание клеток под действием силы тяжести.

Если целевой продукт содержится в самих клетках, то проводят разрушение клеток - дезинтеграцию– физическими, химическими и ферментативными методами.

К физическим методам можно отнести разрушение клеток под действие ультразвука, замораживания-оттаивания, баллистическую дезинтеграцию. Баллистическая дезинтеграция клеток осуществляется в мельницах, куда помещают суспензию клеток и вспомогательные мелющие вещества: песок, стеклянные или полимерные шарики.

К химическим методам дезинтеграции относят разрушение клеток с помощью толуола, бутанола и других химических соединений.

При использовании ферментативной дезинтеграции клеток используют ферменты, способные разрушать определенные структурные компоненты клеточных стенок микроорганизмов. Например, для разрушения бактериальных клеток применяют лизоцимы яиц, бактерий, актиномицетов или грибов. Для разрушения дрожжей и плесневых грибов используются фосфоманназа и бета-глюконаза или применяют автолиз. Автолиз – разрушение клеток дрожжей или плесневых грибов под действием собственных гидролитических ферментов. Для этого суспензию клеток инкубируют при 35-45 ˚С.

Выделение продукта из культуральной жидкости или гомогената разрушенных клеток проводят путем его осаждения, экстракции, кристаллизации или сорбции.

Осаждение в виде нерастворимых солей производят путем добавления химического осадителя в эквимолярных количествах. Применяют при получении лимонной, молочной кислоты.

Экстракция – добавление к раствору экстрагента (растворителя), который поглощает целевой продукт. Затем эмульсию разделяют и выделяют целевое вещество. Используют при получении витаминов, антибиотиков.

Кристаллизация – после предварительной обработки культуральной жидкости и выпаривания при охлаждении осуществляют кристаллизацию. Данный метод выделения и очистки используется при получении глутаминовой, итаконовой и других кислот.

Затем выделенный продукт концентрируют центрифугированием, ультрафильтрацией, выпариванием или обратным осмосом.

Центрифугирование – расслоение раствора с частицами бόльшей плотности на осадок и надосадочную жидкость при воздействии центробежной силы.

Ультрафильтрация – обработка раствора на мембранных фильтрах с определенным размером пор (то есть разделение веществ на фракции по размерам их молекул). Применяется для ферментов и других белков.

Очистка целевого продукта

Эта стадия необходима при получении очищенного целевого продукта, например, ферментных препаратов степени очистки более двухкратной. Эта стадия приводит к росту себестоимости получаемого целевого продукта.

Для очистки ферментов применяют избирательную сорбцию (связывание) каолином, трифосфатом кальция, гидроксидом алюминия и другими адсорбентами. Таким образом проводят сорбцию либо фермента, либо балластных белков, которые затем разделяют центрифугированием. Фермент из сорбента отделяют раствором фосфатного буфера.

На последнем этапе продукт отделяют от примесей, концентрируют и стабилизируют. После стабилизации продукта в зависимости от того, каким должен быть конечный продукт: сухим или жидким, его обезвоживают или сразу упаковывают и отправляют на хранение и далее - потребителю.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ

1. Перечислите основные стадии биотехнологической схемы получения продуктов микробного синтеза.

2. Как определить физиологические потребности микроорганизмов в питательных веществах?

3. Какие методы применяют для обеззараживания питательных сред в биотехнологическом производстве?

4. Опишите последовательность получения посевного материала для промышленного производства целевого продукта.

5. Основное назначение ферментера.

6. От чего зависит проведение стадии выделения целевого продукта?

7. Какие методы применяют для отделения биомассы клеток от культуральной жидкости?

8. Что такое дезинтеграция, в каких случаях ее осуществляют?

9. Расскажите об основных методах дезинтеграции клеток.

10. В чем отличие сепарирования от центрифугирования?

11. В каких случаях выполняется стадия очистки целевого продукта?

12. Что такое сорбция ?

ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ