Кінетика ферментативних реакцій

Під ферментативною кінетикою розуміють залежність швидкості реакції, яка прискорюється ферментом, від хімічної природи субстрату і ферменту й умов їх взаємодії (концентрації, температури, рН середовища, наявності активаторів та ін­гібіторів).

Доцільно звернути увагу на закономірності, які визначаються природою і кон­центрацією реагуючих речовин (субстратів і ферментів) і їх зміною.

Швидкість ферментативної реакції в значній мірі залежить від хімічної при­роди і походження субстрату. Наприклад, різні за природою складові крохмалю -амілоза і амілопектин з різною швидкістю гідролізуються амілазами і до того ж потребують неоднакового набору амілолітичних ферментів. Зокрема, для гідролізу амілози достатньо а-амілази, а для гідролізу амілопектину, крім а-амілази необхід­ні і ферменти, які каталізують гідроліз a-1,6-глюкозидних зв'язків, тобто глюкоа-мілаза;або декстриназа.

На швидкість і умови ферментативних реакцій впливає і походження фермен­ту. Ферменти солоду гідролізують крохмаль до декстринів, мальтози і незначної кількості (3-5%) глюкози, а ферменти мікробного походження - до декстринів і глюкози. Крім того, ос-амілаза бактеріального походження (ферментні препарати Амілодіастатін, Термаміл та ін.) мають більш високу оптимальну температуру дії (до 90-115° С), що можна корисно використати для створення нових технологій оцукрювання крохмалю сировини.

Ферменти мікробного походження більш стійкі в порівнянні із ферментами солоду до низьких значень рН середовища. Це особливо важливо для створення у виробничих умовах асептичних умов за рахунок зниження рН живильних середо­вищ, що запобігає розвитку кислоутворюючих бактерій.

Концентрація ферменту

Швидкість більшості ферментативних реакцій пропорційна концентрації фе­рменту, особливо це справедливо на найбільш ранніх стадіях. Ця пропорційність є основою методів визначення концентрації ферменту.

Початкову швидкість реакції можна визначити з тангенсу кута нахилу кривої залежності кількості субстрату, яка вступила в реакцію від тривалості реакції на

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

початку координат (до перетворення субстрату не більше 20-25%). Під час подаль­шого перетворення субстрату не зберігається пропорційність залежності тривалос­ті реакції від кількості ферменту.

Концентрація субстрату

Вплив концентрації субстрату на початкову швидкість ферментативної реак­ції має суттєве значення. Криві, які характеризують цю залежність є частиною гі­перболи (рис. 4.1).

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

Рис. 4.1 Залежність швидкості ферментативної реакції V від концентрації субстрату кінетика ферментативних реакцій - student2.ru при постійній кількості ферменту

Такі криві характерні для всіх процесів, під час яких проходить проста дисоціація.

У 1913 р. Л.Мехаеліс і М.Ментен розробили теорію дії ферментів, яка перед­бачає утворення комплексу фермент-субстрат внаслідок оборотної реакції

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

Припустивши, що комплекс кінетика ферментативних реакцій - student2.ru утворюється дуже швидко, так що він завжди знаходиться в рівновазі з кінетика ферментативних реакцій - student2.ru , а розщеплення кінетика ферментативних реакцій - student2.ru на Е і Р проходить порівняно   ьпиьрпорівняно порівняно


Константа рівноваги цієї реакції, або її зворотна величина, яку називають кон­стантою дисоціації фермент-субстратного комплексу кінетика ферментативних реакцій - student2.ru залежить від природи субстрату і ферменту і відображає ступінь їх спорідненості. Чим нижче значення кінетика ферментативних реакцій - student2.ru тим вища спорідненість ферменту до субстрату. Наприклад, для кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -фруктофура-нозидази (сахарази) кінетика ферментативних реакцій - student2.ru тобто концентрація фермент-субстратного компле­ксу перевищує концентрацію вільних ферментів і субстрату приблизно в 60 разів. Концентрація фермент-субстратного комплексу змінюється внаслідок перетво­рення останнього в продукт реакції із регенерацією вільного ферменту


кінетика ферментативних реакцій - student2.ru


повільно і практично не впливає на концентрацію фермент-субстратного комплек­су, отримаємо рівняння, яке характеризує зв'язок швидкості ферментативної реак­ції V із концентрацією субстрату кінетика ферментативних реакцій - student2.ru :

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

Їм І

де кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - максимальна швидкість реакції, яка досягається при великих значеннях S,

і при оптимальній температурі та рН середовища, тобто в тих випадках, коли зна­менник правої частини рівняння близький до 1;

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - константа Михаеліса, константа дисоціації в реакції утворення комплек­су фермент-субстрат, вона має розмірність концентрації і при кінетика ферментативних реакцій - student2.ru дорі­внює концентрації субстрату, при якій швидкість ферментативної реакції дорівнює половині максимальної (рис. 4.1).

Величина кінетика ферментативних реакцій - student2.ru залежить від природи ферменту і субстрату і відображає спорід­неність ферменту субстрату. Низька величина кінетика ферментативних реакцій - student2.ru свідчить про високу спорідне­ність ферменту із субстратом, бо максимальна швидкість реакції досягається уже при низьких концентраціях субстрату.

Якщо фермент насичений субстратом, то його дія не залежить від концентра­ції субстрату, а тільки від кількості ферменту І прямо пропорційна їй.

У тому випадку, коли концентрація субстрату менша величини кінетика ферментативних реакцій - student2.ru , тоді дія ферменту не залежить від його кількості, а залежить головним чином від концент­рації субстрату.

Для прикладу в табл. 4.1 наведені значення кінетика ферментативних реакцій - student2.ru для глюкоамілази в залежності від субстрату.

Табл. 4.1 Вплив виду лінійних поліцукридів на величину К

Субстрат Довжина ланцюга кінетика ферментативних реакцій - student2.ru , молярна кінетика ферментативних реакцій - student2.ru
  субстрату, концентрація  
  глюкозних    
  одиниць    
Мальтоза 1,16×10-3 0,513
Мальтотріоза 2, 02×10-4 1,150
Амілодекстрин 4,90×10-5 0,855
Амілоза 3,84×10-6 0,783

Для коротких інтервалів часу і для найбільш ранніх стадій ферментативної реакції можна припустити, що концентрація субстрату залишається майже постій­ною, особливо у випадках, коли субстрату міститься значний надлишок. У таких умовах проходження реакції підпорядковується закону нульового порядку, а кіль­кість утвореного продукту пропорційна тривалості реакції

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

де кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - константа реакції нульового порядку. У цих реакціях кількість кінцевого продукту подвоюється, якщо подвоюється тривалість реакції.

Якщо ж ферментативна реакція виходить за межу початкової стадії, необхідно враховувати безперервне зменшення концентрації субстрату, що приводить до спо­вільнення реакції. Більшість ферментативних мономолекулярних реакцій підпо­рядковується кінетичному закону реакції першого порядку

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

де кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -константа реакції першого порядку; кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - концентрація субстрату, що за-

лишився в будь-який заданий час.

Швидкість реакції прямо пропорційна концентрації субстрату, що залишився. У рівні проміжки часу перетворюється половина кількості субстрату, що залиши­лась. Наприклад, якщо за першу годину перетворилося 50% субстрату, то за другу - 25% початкового, за третю - 12,5% і так далі.

Після інтегрування попереднього рівняння одержимо

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

Таким чином, швидкість гідролізу поліцукридів при постійній концентрації ферменту і температурі пропорційна тільки концентрації поліцукридів у розчині. Гідроліз поліцукридів одним ферментом описується кінетичним рівнянням першо­го порядку.

У випадку дії на поліцукриди декількох амілаз у результаті дії кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілази утво­рюється значна кількість нередукуючих кінців, що полегшує і прискорює дію ін­ших амілаз - кінетика ферментативних реакцій - student2.ru амілази або глюкоамілази.

Температура

Температура впливає на швидкість реакції утворення фермент-субстратного комплексу і на всі наступні етапи перетворення субстрату, що призводить до при­скорення каталізу. При енергії активації 48 кДж-кмоль кінетика ферментативних реакцій - student2.ru (для ферментативного гід­ролізу крохмалю вона дорівнює 45 кДж-кмоль кінетика ферментативних реакцій - student2.ru ) швидкість реакції подвоюється при збільшенні температури від 22 до 32° С.

При значному підвищенні температури проходить теплова денатурація фер­ментативного білку, що призводить до поступової втрати ферментом каталітичних властивостей, проявляється теплова інактивація.

Тому при температурах, вищих 50° С, денатурація ферментативного білка різко посилюється, і хоч швидкість перетворення субстрату продовжує рости, активність ферменту, виражена кількістю перетвореного субстрату за одиницю часу, падає.

Температура, при якій каталітична активність ферменту максимальна, назива­ється його температурним оптимумом.


кінетика ферментативних реакцій - student2.ru


Температурний оптимум для різних ферментів неоднаковий.

Якщо визначити константу швидкості реакції при двох різних температурах, то енергія активації може бути виражена такою формулою (відповідно із рівняння Арреніуса)

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

де А - енергія активації, кДж-кмоль кінетика ферментативних реакцій - student2.ru ;

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - універсальна газова постійна , дорівнює 8,3134 кДж/(моль • К); кінетика ферментативних реакцій - student2.ru і Т2 - абсолютні температури, К;

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru і кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - константи швидкості реакцій відповідно при температурі кінетика ферментативних реакцій - student2.ru і Т2. Чим нижча енергія активації, тим досконаліше проходить процес. Зміни активності в залежності від температури різні у одного і того ж ферме­нту, але різного походження. Наприклад, термостабільність амілаз можна записати в такій послідовності: бактеріальна > солодова > грибна.

Температурний оптимум для ферментів солоду із різних культур зерна неод­наковий (рис. 4.2). Для ячмінного і просяного солодів він не перевищує 55° С, для вівсяного - 50° С.

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

Рис. 4.2 Вплив температури на оцукрюючу здатність солодів:

1 - житнього; 2 - пшеничного; 3 - ячмінного; 4 - кукурудзяного;

5 - просяного; 6 - вівсяного

При подальшому підвищенні температури проходить теплова денатурація біл­кової молекули фермента і зниження а£о повна втрата (75-85° С) каталітичної акти­вності (дані приведені для гідролізу 2%-ного розчину крохмалю). Підвищення кон­центрації вуглеводів у суслі сприяє збільшенню їх термостабільність Наприклад, оптимальна температура для дії кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілази ячмінного солоду в суслі - біля 70° С, кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілази - 60° С. У виробничих умовах температуру оцукрювання тримають в межах 57-58° С. Небажана менша температура, бо вона може сприяти розвитку кислотоутворюючих бактерій.

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілази мікробного походження мають різні температурні оптимуми дії (в °С): кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - 52, кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - 55, кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - 60, кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - 70,

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru - 80. Глкжоамілази різних продуцентів мають температурний опти­мум 55-60° С.

Іноземні фірми ( кінетика ферментативних реакцій - student2.ru , Данія та ін.) виробляють концентровані ферме-

нтні препарати, які мають різні температурні оптимуми. Наприклад, ферментні препарати, які містять кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілазу, кінетика ферментативних реакцій - student2.ru (продуцент селекційований штам

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru ) відрізняється високою термостабільністю - 90-95° С; кінетика ферментативних реакцій - student2.ru (продуцент селекційований штам кінетика ферментативних реакцій - student2.ru І - 75° С.

Ферментний препарат кінетика ферментативних реакцій - student2.ru , що містить глюкоамілазу (продуцент селекційо-

ваний штам кінетика ферментативних реакцій - student2.ru ) має температурний оптимум 75° С, рН - 4,0-4,5. Ак-

тивно діє протягом усього періоду бродіння.

Ферментний препарат кінетика ферментативних реакцій - student2.ru . містить глюкоамілазу, грибну кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілазу і

бактеріальну нейтральну протеіназу. Оптимум дії - 55° С.

Під час зброджування сусла (температура 28-30° С) бактеріальні кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілази май­же припиняють каталітичну дію, тоді як кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілаза мікроміцетів продовжує діяти.

Оптимум температури дії ферментів залежить від тривалості реакції - для ко­ротких періодів оптимальна температура більш висока, ніж для тривалих.

Температурний оптимум дії амілаз не співпадає з оптимальною температурою їх стабільності. Оптимальна температура стабільності ферментів нижча темпера­турного оптимуму їх активності.

У першій основній стадії оцукрювання крохмаль гідролізується частково і гі­дроліз продовжується при зброджуванні сусла. Тому для зберігання активності амі-лолітичних ферментів температура в першій стадії оцукрювання не повинна пере­вищувати оптимальну. У виробничих умовах вона складає 57-58° С.

Продукти гідролізу крохмалю і білки сповільнюють інактивацію ферментів. Тому у виробничому суслі оптимальна температура оцукрювання може збільшува­тися з підвищенням концентрації сухих речовин.

Величина рН середовища

Зміни рН середовища значно впливають на активність ферментів. Вплив кон­центрації іонів водню на каталітичну активність ферментів полягає у впливі на їх активні центри. При різних значеннях рН реакційного середовища активний центр може бути більше або менше екранований сусідніми з ним фрагментами поліпеп-тидного ланцюга білкової частини ферменту, більш сильно або слабоіонізований. Кислотні й основні групи ферментів здатні до іонізації. При зміні рН середовища внаслідок приєднання кінетика ферментативних реакцій - student2.ru кінетика ферментативних реакцій - student2.ru кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -іонів зменшується ступінь іонізації одних або

других груп. У тому випадку, коли ці групи є активними центрами ферментів, іони кінетика ферментативних реакцій - student2.ru або кінетика ферментативних реакцій - student2.ru відіграють роль конкурентних інгібіторів ферментів. В інших випадках іони кінетика ферментативних реакцій - student2.ru *бо кінетика ферментативних реакцій - student2.ru призводять до порушення конформації і комплементарності фер­менту і субстрату, тобто виступають як реконкурентні інгібітори.

Крім того, рН середовища впливає на сутність іонізації субстрату, фермент-субстратного комплексу і продуктів реакції, має великий вплив на стан ферментно-

кінетика ферментативних реакцій - student2.ru

----------------------------------------- Одержання солоду та мікробних ферментних препаратів ------------

го білка, визначаючи співвідношення в ньому катіонних і аніонних центрів, що впливає на третичну структуру білкової молекули. Певна третична структура біл-ка-фермента необхідна для утворення фермент-субстратного комплексу.

Оптимальне значення рН дії ферменту залежить від природи ферменту і суб­страту, його концентрації, від стабільності ферменту, температури середовища та тривалості каталітичної реакції.

Термін "оптимум рН" не має строго визначеної фізичної суті. Правильніше показувати межі рН, сприятливі для даної ферментативної реакції.

Максимальна активність кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -амілази ячмінного солоду при рН 5,4-5,7,1 кінетика ферментативних реакцій - student2.ru -аміла­зи - 4,5-5,0.

З підвищенням температури середовища оптимальне значення рН дії фермен­ту збільшується. Наприклад, оптимальне значення рН дії амілаз при температурі 50° С - 4,8, 60° С - 5,1, 70° С - 5,9.

Більшість глюкоамілаз кінетика ферментативних реакцій - student2.ru має оптимальне значення рН 4,5. Тому в

процесі зброджування сусла активність глюкоамілаз у значній мірі зберігається, навіть при зниженні рН до 4,0.

Амілази мікробного походження більш стабільні в порівнянні з амілазами со­лоду при знижених значеннях рН бражки, що дуже важливо для умов спиртового виробництва. Це дозволяє більш повно провести дооцукрення граничних декстри­нів бражки навіть при зниженні її рН.

Наши рекомендации