Негидролитические ферменты

В практике пока используется очень небольшое количество таких ферментов: глюкозооксидаза, каталаза, пероксидаза и липоксигеназа (липооксидаза). Кроме того, в сырье всегда учитывается действие оксидазы аскорбиновой кислоты, фенолоксидазы (тирозиназы) и некоторых других ферментов.

Ферменты глюкооксидазной системы могут быть использованы для двух основных целей – окисления глюкозы и связывания (удаления) кислорода.

С₆Н₁₂О₆ + О₂ + Н₂О глюкооксидаза С₆Н₁₂О₇ + Н₂О₂

Глюконовая к-та

Основные области применения фермента: 1. Предохранение пищевых продуктов от окисления (удаление из них кислорода); 2. Предохранение продуктов от нежелательных изменений путем предварительного окисления глюкозы, входящей в их состав; 3. Хранение и транспортировка окисляющихся материалов в бескислородных условиях.

Широкое промышленное применение имеет процесс обессахаривания яиц перед их высушиванием. Если в яичном порошке содержится глюкоза, то ее постепенное окисление приводит к ухудшению продукта – появлению коричневой окраски, неприятного привкуса и др. Предварительное окисление глюкозы в глюконовую кислоту предотвращает эти нежелательные изменения.

При хранении жидких продуктов глюкозооксидазу вместе с небольшим количеством глюкозы растворяют в них перед упаковкой, и весь остаточный кислород в продукте оказывается связанным (удаленным). При хранении, например, консервированных безалкогольных напитков в них могут происходить три вида весьма нежелательных изменений: потеря цвета, изменение запаха и коррозия банки. В зависимости от количества оставшегося кислорода могут возникать разнообразные запахи с различной интенсивностью. Прибавление небольших количеств фермента сильно увеличивает сроки хранения напитков при сохранении их качества и уменьшает коррозию металлических банок. Поэтому фермент применяют для предохранения разнообразных фруктовых соков, яблочного вина, газированных безалкогольных напитков и пива.

Глюкозооксидаза эффективна при выработке майонезов. Этот продукт представляет собой водно-масляную эмульсию, содержащую много воздуха и обычно хранимую на свету, при комнатной температуре. Масло подвергается воздействию самых неблагоприятных факторов, быстро вызывающих порчу и прогоркание. Если из майонеза удалить кислород, введя в него 20-50 мг% препарата фермента, то срок хранения продукта резко возрастает и признаков прогорклости, изменений цвета или увеличения количеств перекисей не обнаруживается через 6 и даже 12 месяцев.

Большое внимание привлекло запатентованное в 70-х годах изобретение – деоксигенерирующие пакеты (удаляющие кислород). Их изготавливают из пленки, через которую проходит кислород или воздух, но не проникает вода, например из полиэтиленовой. В пакеты вносят глюкозу, соответствующий буферный раствор для поддержания реакции среды и ферменты – глюкооксидазу и каталазу. Затем их помещают в герметически закрытые контейнеры, банки или ящики, где находятся продукты, которые нужно защитить от окисления: жиры, пищевые концентраты, содержащие жир и др. Пакеты полностью поглощают кислород в контейнере и хранимые материалы далее находятся в бескислородной среде. Прекращается также доступ к продуктам новых порций кислорода из атмосферы.

Заметное практическое использование находят еще два негидролитических фермента – каталаза и пероксидаза.

Н₂О₂ каталаза О₂ + 2Н₂О

Каталаза окисляет саму Н₂О₂, некоторые спирты и не действует на большинство соединений, которые «подвластны» пероксидазе, эта последняя не окисляет Н₂О₂, но окисляет множество веществ – фенолы, амины, некоторые гетероциклические и многие другие вещества.

Известны два основных типа использования каталазы: прекращение действия перекиси водорода, точнее устранение ее избытка в системе, или получения из нее кислорода. Хотя перекись водорода в промышленности используется довольно широко, применение ее осложняется и всегда опасно из-за сильного действия этого вещества. Процесс использования Н₂О₂ всегда должен быть таким, чтобы остаток или избыток (по окончании действия) мог быть быстро и надежно удален. Для этой цели особенно удобным агентом является каталаза.

Остаток перекиси удаляется:

a) при отбеливании Н₂О₂ различных материалов;

b) при стерилизации молока и яичной массы;

Благодаря каталазе оказывается возможной холодная стерилизация молока при производстве сыра. Такая стерилизация производится действием Н₂О₂. При помощи фермента разрушают оставшийся вредный избыток перекиси водорода, и в молоке в дальнейшем может быть обеспечен рост необходимой для сыроварения культуры микроорганизмов, которую специально вводят после обработки молока.

Липоксидаза (липоксигеназа) катализирует окисление кислородом воздуха ненасыщенных жиров (жирных кислот) с образованием их пероксидов. Фермент действует специфично и присоединяет молекулу О₂ к двойным связям только в положении С₉-С₁₀ у ненасыщенных жирных кислот. Нужно, чтобы в молекуле жирной кислоты было не меньше двух двойных связей. Такому условию отвечают только три кислоты: линолевая, линоленовая, арахидоновая, которые, находясь в пищевых продуктах, окисляются наиболее легко. Только эти кислоты и окисляются липоксигеназой, причем образуются соответствующие перекиси. Реакция протекает по следующей схеме:

(6) (7) (8) (9) (10) (6) (7) (8) (9) (10)

-СН=СН-СН₂-СН=СН- + О₂ -СН=СН-СН₂-СН-СН-

О - О

При использовании липоксигеназа обладает положительным и отрицательным действием.

Положительное действие проявляется: а) в отбеливающем влиянии на тесто, улучшении свойств хлеба; б) в улучшении (на начальных этапах процесса) макаронных изделий, клейковины муки; в) в улучшении состояния кожи человеческого тела.

Отрицательное действие липоксигеназы выявляется в том, что катализируемые ею реакции окисления приводят к прогорканию и порче многих пищевых продуктов, в первую очередь муки и крупы, к потере каротина и витамина А в тех продуктах, где их желательно сохранить.

Гидроперекиси жирных кислот обладают способностью окислять каротиноиды, окрашивающие в желтый цвет муку и многие иные продукты; при этом образуются бесцветные вещества. Если липоксигеназа слабо подействовала на тесто и в нем образовалось небольшое количество перекисей, то последние укрепляют клейковину муки, улучшают ее физические свойства. На этом основан способ улучшения хлебопекарных качеств муки, основанный на том, что в тесто прибавляют небольшое количество соевой муки, богатой липоксигеназой, и некоторое количество растительного масла – субстрата окисления.

При окислении гидроперекисями жирных кислот образуются различные альдегиды и кетоны, они придают муке, крупе и др. пищевым продуктам неприятный вкус и запах. Бороться с данным процессом можно, уничтожая (инактивируя) соответствующие ферменты – липоксигеназу и липазу. В хлебопечении это производят обработкой муки горячим водяным паром – пропариванием.

Большое практическое значение имеют полифенолоксидазы и оксидаза аскорбиновой кислоты (аскорбинатоксидаза), которые, в первую очередь, влияют на внешний вид плодоовощного сырья и продуктов и вызывают их потемнение при хранении и технологической обработке. Наиболее характерным выявлением действия полифенолоксидазы является появление темной окраски на разрезе у сырого картофеля, яблок, лука. Из-за этого сушеный картофель (ломтики) или сушеные яблоки приобретают крайне непривлекательный вид. Макароны также могут сильно потемнеть, если активность фермента в муке была высокой.

Наоборот, в производстве черного чая дубильные вещества, которые в нем содержатся, вступают в контакт с ферментом и окисляются; при этом появляются соединения темного цвета, которые и определяют внешний вид черного чая.

Существуют различные способы предотвращения нежелательных процессов, катализируемых фенолоксидазами: физические и химические. Первые включают полное удаление кислорода из системы; инактивирование ферментов нагреванием (бланшировка от французского слова blanch-белый – кратковременное погружение в кипяток или обработка паром) или подкислением среды.

Химических способов известно больше: а) прибавление веществ, реагирующих с хинонами или иными промежуточными продуктами окисления и устраняющими полимеризацию их в окрашенные продукты (сульфит натрия, аскорбиновая кислота и другие восстановители); б) ингибирование действия ферментов добавлением конкурентных ингибиторов (нитрофенолов, бензойной и некоторых других ароматических кислот); в) блокирование меди в составе фермента; г) добавление веществ, которые реагируют не с ферментом, а с субстратом и образуют соединения, которые фермент не окисляет.

Наиболее распространенные способы борьбы с потемнением плодов и фруктов – это бланшировка или химическая обработка перед высушиванием бисульфитом натрия или сернистым газом (SO₂). Оба эти вещества образуют сернистую кислоту (Н₂SO₃), которая инактивирует фенолазу, будучи сильным восстановителем. Она обесцвечивает даже те окрашенные вещества (меланины), которые уже образовались. Все же использование сернистой кислоты имеет и отрицательные стороны, в частности, опасна возможность окисления ее в серную и затем образование сульфата натрия, который неблагоприятно влияет на желудочно-кишечный тракт ….

На практике в молочной промышленности ферментативные реакции используют не только для получения готовых продуктов, но и для контроля качества молока. Например, степень микробиологического загрязнения молока оценивают по редуктазной пробе. Редуктазу вырабатывают микроорганизмы, которые развиваются в молоке до его переработки. Чем больше в молоке м.о., тем больше соответствующего фермента, а редуктаза имеет способность обесцвечивать краситель метиленовый синий путем его восстановления. Таким образом, исследуемым путем установлена зависимость между м.о. в определенном объеме молока и временем обесцвечивания молока при добавлении метиленового синего.

Ферменты, как белковые соединения, при определенных высоких температурах инактивируются за счет коагуляции белковой части. Это свойство используют для определения эффективности пастеризации молока.

К гидролитическим ферментам, которые имеют значение в пищевых технологиях относятся ферменты пектолитического действия (протопектиназы, эндо-, экзополигалактуроназы, катализирующие расщепление пектиновых веществ плодов и овощей до соединений с меньшей молекулярной массой. Эти ферменты используют с целью размягчения растительных тканей для более полного выделения соков, а также в процессах осветления соков и вин. К гидролитическим ферментам относят также амилазы, липазы и др.

Во многих пищевых технологиях ферментативные процессы используют для экстрагирования. С помощью ферментов извлекают, например, полисахариды из отходов соковых производств. Роль таких ферментов в процессах экстракции сводится к расщеплению межмолекулярных связей между субстратом и другими компонентами сырья и внутримолекулярных связей. Последнее необходимо для того, чтобы интенсифицировать собственно экстракцию из сырья в жидкость.

Обычно промышленные ферментативные препараты не обладают каким-либо одним видом катализа, т.к. их вырабатывают на основе микробиологического синтеза, а микроорганизмы в процессе жизнедеятельности вырабатывают целый ряд ферментов.

Разделение одних ферментов от других является сложной задачей, поэтому ферменты с достаточно высокой активностью стоят дорого. Обычно в промышленности используют ферментные препараты, которые кроме коммерческого названия имеют буквенные обозначения. В буквенном названии кроме буквы, указывающей на класс, есть буква, обозначающая способ культивирования, а цифра означает степень очистки.

Например, П10 х; Г3 х

Практически обработку жидких пищевых сред проводят в ферментаторах, которые представляют собой термоизолированную емкость, снабженную стальной рубашкой и мешалкой. В ферментаторе имеются патрубки для ввода жидкого продукта, буферных веществ и для выпуска готового продукта. Сущность ферментной обработки заключается в том, что к продукту добавляют небольшое количество ферментного препарата и если это необходимо буферные соли. Затем при перемешивании продукт выдерживают от 30 мин до нескольких часов. В конце обработки фермент инактивируют, чаще всего нагреванием. Продукт передают на дальнейшую обработку, а процесс повторяют для новой партии сырья, т.е. всякий раз используют все новое и новое количество ферментов. Кроме того, по такому способу обработки для осуществления непрерывности требуется большое число емкостей.

В производственных условиях используют сухие либо жидкие ферментные препараты. Жидкие представляют собой концентраты очищенных либо неочищенных водных растворов фермента с помощью центрифугирования или с помощью полимерных мембран, а сухие с помощью сублимационной сушки, сущность которой заключается в замораживании жидкого раствора с дальнейшей возгонкой льда, что позволяет переводить в пар минуя жидкость. В таких условиях активность ферментов хорошо сохраняется.

В последнее время с целью устранения вышеуказанных недостатков (длительность процесса, дороговизна ферментных препаратов и одноразовое использование, большое число ферментаторов), стали применять метод иммобилизации.

Иммобилизованные ферменты или ферменты пролонгированного действия представляют собой, более ли менее чистые ферментные препараты или даже колонии микроорганизмов, которые четко зафиксированы, связаны на различных носителях.

Сущность иммобилизации ферментов – прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе, заключение в гель или в полупроницаемую мембранную систему.

Для иммобилизации используют неорганические и органические носители, к которым предъявляются следующие требования:

1. нерастворимость носителя в обрабатываемой среде;

2. отличие по электрическому заряду от заряженных ферментов;

3. высокая химическая, биологическая и механическая устойчивость;

4. отсутствие неспецифического действия на субстрат (адсорбции);

5. высокая гидрофильность;

6. легкая обработка носителя для производства различных насадок (грану, колец и т.д.).

Среди органических носителей используют полиэтилен, полипропилен, фенолформальдегидные смолы и некоторые полисахариды (декстрины, целлюлозу). В некоторых случаях используют неорганические носители в виде селикогеля, асбеста, оксиды металлов. Все эти соединения обрабатываются специальным методом, чтобы придать большую площадь контакта иммобилизованного фермента и субстрата. Носители иммобилизованных ферментов называют матрицами. Их изготавливают в виде гранул, колец, конусов и помещают в специальные термоизолированные колонки, в которых необходимо поддерживать температуру, и если необходимо, соответствующую рН. Ферменты фиксируют на носителях физическими или химическими способами.

Все способы иммобилизации делят на:

1. физические

2. химические

В большинстве случаев в промышленных масштабах используют химическую иммобилизацию, т.к. она более эффективна при грануляции, нежели физическая иммобилизация. Она заключается в связывании ферментов за счет ковалентных связей. Химическая связь дает более стабильные результаты, однако, при этом утрачивается активность ферментов.

Между тем иммобилизованные ферменты легко отделить от продукта, они удобны при применении, их можно многократного использовать, фермент не загрязняет продукт. При иммобилизации представляется возможным менять и целенаправленно модифицировать свойства фермента. Наконец, иммобилизованные ферменты обычно более стабильны к действию температуры и рН среды.

Этот способ более выгоден, чем периодический метод.

Установка на иммобилизованных ферментах имеет следующий вид:

1- емкость для поступающего продукта

2- насос

3- вентиль

4- ферментативные колонки, объединенные

в батареи

5- емкость для конечного продукта

Если по периодическому способу каждая обработка новым ферментом другого действия требует других условий растворения, то с помощью колонок можно одно и тоже вещество обрабатывать разными ферментами непрерывно в потоке. При соответствующем открытии, закрытии вентилей можно организовать или параллельную или последовательную циркуляцию, а также выключение соответствующих колонок с целью их санитарной обработки.

Области применения иммобилизованных ферментов

Пищевая и фармацевтическая промышленность	- Производство фруктозной патоки из глюкозы на основе иммобилизованной глюкозоизомеразы; - Производство D-фруктозы из D-глюкозы на основе иммобилизованной пиранозо-2-оксидазы; - Получение L-аминокислот из рацемата с использованием аминоацилазы; - Получение 6-аминопенициллановой кислоты на основе иммобилизованной пенициллинамидазы
Медицина	Создание лекарств пролонгированного действия со сниженной аллергенностью и токсичностью

Применяют также при органическом синтезе, в аналитических исследованиях, в бессеребряных фотографиях и т.д.