Замораживание и длительное хранение спермы быка

Станции и племпредприятия по искусственному осемене­нию широко применяют метод замораживания и дли­тельного хранения спермы быков в жидком азоте при температуре -196°С. В таком состоянии сперму можно хранить в течение многих месяцев или нескольких лет без потери оплодотворяющей способности. Для замора­живания и хранения спермы используют специальные аппараты и стационарные хранилища (КВ-6202 и др.). Из хранилищ сперму транспортируют в обслуживаемые хозяйства в сосудах Дьюара различного объема. Сперму быков используют для замораживания с концентрацией спермиев не менее 0,7 млрд. в 1 мл и активностью спер­миев не ниже 8 баллов. Сперму замораживают в грану­лах на фторопластовой пластине, в облицованных грану­лах и в полипропиленовых соломинках (пайеттах).

Замораживание спермы в форме гра­нул на фторопластовых пластинах. После получения и оценки сперму быков разбавляют лактозо- желточной средой с глицерином. Перед разбавлением среду подогревают до 30 — 35°С. Сперму разбавляют в 2, 10 раз и более в зависимости от объема гранул. Если применяют гранулы спермы объемом по 0,1—0,2 мл, то для них требуются меньшие степени разбавления. На пункте искусственного осеменения такие гранулы разбав­ляют. Для этого их оттаивают во флаконе с 1 мл 2,9%- ного раствора натрия лимоннокислого, подогретого до температуры 38 — 40°С.

Для замораживания спермы в гранулах объемом 0,5 мл сперму разбавляют в 10 раз и более. Эти гранулы перед осеменением коров не разбавляют. Для осемене­ния коров берут две данные гранулы, помещают в сте­рильный флакон или пробирку и погружают флакон в теплую воду (38 — 40°С) для оттаивания гранул.

Для замораживания в гранулах сперму после раз­бавления охлаждают до температуры 2 — 5°С в течение 3 — 4 ч, а затем разливают градуированными пипетка­ми, полиэтиленовым шприцем или разливочной маши­ной в лунки охлажденной в жидком азоте фторопла­стовой пластины (рис. 29). После разлива пластину со спермой выдерживают над поверхностью жидкого азота на расстоянии 5 — 10 см в течение 1^1/2— 2 мин, а затем погружают ее в жидкий азот на 1— 2 мин. После замо­раживания спермы пластину вынимают из жидкого азо­та, гранулы собирают в сачок или контейнер, затем пересыпают их в охлажденный контейнер, который по­мещают в сосуд Дьюара с жидким азотом для хранения. В таких сосудах гранулы хранят и на пунктах искусст­венного осеменения.

Уровень азота в сосудах должен быть значительно выше чашек с замороженной спермой. Перед осеменением гранулы из чашек достают охлаж­денным до — 196°С пинцетом, оттаивают их, оценивают активность спермиев и используют для осеменения коров при активности спермиев не ниже 4 баллов.

Замораживание спермы в облицован­ных гранулах (по Осташко).

По этому методу для замораживания используют свежеполученную сперму, разбавленную средами № 1 и 2. Приготовленные среды наливают в стерильные полиэтиленовые емкости по 200 — 400 мл, которые подсоеди-няют к специальному устройст­ву для разбавления спермы.

После получения спермы ее разбавляют средой № 1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной темпе­ратуре 5 — 10 мин. Затем разбавляют сперму средой № 2 до требуемой концентрации (15 млн. в дозе).

Разбавление производят с помощью специального устройства, позволяющего дозированно вводить среды в отдаленную часть одноразового полиэтиленового спермо- приемника со спермой. Спермоприемник соединяют с тон­костенной полимерной трубкой диаметром 3,8 — 4 мм, с толщиной стенки 120 мкм и выдавливают в нее разбав­ленную сперму. Заполненную спермой трубку разделяют с помощью автомата ПРЖ на отдельные дозы по 0,25 — 0,33 мл и герметизируют путем термической сварки. Облицованные (герметизированные) гранулы помещают в алюминиевые тубы, которые закрывают поролоновыми пробками и закрепляют в обоймы специального уст­ройства для эквилибрации и замораживания спермы. Это устройство помещают в холодильник для охлажде­ния до 2 — 5°С. После 4 — 6-часовой выдержки при данной температуре обойму аппарата с тубами погружают в емкости с жидким азотом на 8 — 10 мин (рис. 30), а за­тем полностью погружают в него до проверки качества спермы.

Рис. 30. Схема технологии консервирования спермы в облицованных гранулах (по Осташко): 1 — Спермоприемник после отделения пробирки с пробой спермы для оценки; 2 — термостатное дозирующее устройство для асептического разбавления спермы; 3 — фасование спермы в тонкостенную полиэтиленовую трубку из спермоприемиика; 4 — термоимпульсный аппарат для дозирования и гермети­зации спермы в пленочной облицовке; 5 — замораживание спермы; 6 — одно­разовый полимерный инструмент для осеменения коров.

Активность спермиев после замораживания спермы прове-ряют через 24 ч. Из каждой тубы берут по одной грануле и помещают их в воду температурой 40°С для оттаивания. Упаковку гранулы вытирают марлевой сал­феткой, с помощью ножниц вскрывают ее и определяют активность спермиев. После проверки активности для дальнейшего хранения в жидком азоте допускают сперму с активностью не ниже 4 баллов. После проверки при хорошем качестве спермы тубы закрывают поролоновыми пробками, отсоединяют от обоймы и помещают в храни­лище с жидким азотом для хранения.

Замораживание спермы в соломин­ках (пайеттах). При замораживании используют полипро-пиленовые трубочки емкостью 0,25 мл. Сперму разбавляют лактозо-фруктозо-раффинозо-магниево-глицерино-желточной средой (ЛФРМГЖ) с таким расчетом, чтобы в соломинке (пайетте) содержалось после оттаи­вания не менее 15 млн. подвижных спермиев. Каждую соломинку маркируют с указанием наименования пред­приятия, клички и номера быка, даты получения спермы. После разбавления сперму расфасо-вывают по 0,25 мл. Для этого используют машину, которая автоматически наполняет спермой соломинки и закупоривает их с обоих концов стерильными шариками. Один шарик использует­ся как пробка-поршень, а другой герметизирует соло­минку.

Можно соломинки наполнять спермой вакуумным спо­собом. Для этого применяют специальную вакуумную камеру. Соломинки с одного конца закупоривают проб­кой-поршнем, связывают в пачку и подвешивают к шта­тиву камеры. На поддон камеры ставят стакан со спер­мой и насосом откачивают воздух до давления 0,92 атм, затем насос выключают, при помощи ручки поднимают поддон со спермой до погружения открытых концов соло­минок в сперму на 4 — 5 мм. После этого в камеру мед­ленно впускают воздух, который нагнетает сперму в соломинки. Соломинки после наполнения их спермой рас­кладывают на штатив с зубцами посредством счетных реек с 125 пазами. Счетную рейку заполняют соломин­ками легким движением ладони руки. Потом штатив снимают с рейки, между зубцами штатива размещаются соломинки. Штативы с соломинками кладут в пласт­массовые коробки, которые ставят для охлаждения в холодильник при температуре 4°С на 3 — 4 ч. После охлаждения оценивают подвижность спермиев и для за­мораживания допускают сперму с оценкой не ниже 8 баллов. Сперму замораживают в газообразном азоте на медном сите в стационарном хранилище КВ-6202 при температуре —120 — 130°С в течение 5 мин. Замо­роженную сперму в соломинках помещают в пластмас­совые стаканы, в которые входит до 500 шт., и хранят в стационарном хранилище в жидком азоте при темпе­ратуре — 196°С. Для хранения и транспортирования спермы на пункты используют другие пластмассовые стаканы, вмещающие до 150 доз спермы, которую хра­нят в сосудах Дьюара в жидком азоте. Для осеменения берут сперму не раньше 14 — 20 дней после заморажи­вания.

На пункты искусственного осеменения замороженную сперму быков доставляют в хозяйства 2 — 4 раза в год и используют ее по мере надобности. Раз в месяц необ­ходимо пополнять сосуды жидким азотом, в которых хранится сперма. Нельзя преждевременно оттаивать сперму или повторно ее замораживать.

Проверка активности замороженной спермы. Высокая оплодотворяемость животных при искусственном осемене­нии обеспечивается при использовании только высоко­качествен-ной спермы. Поэтому перед каждым осеменени­ем животных необходимо проводить тщательную про­верку ее качества.

Для проверки активности спермы, сохраненной при температуре 2 — 5°С, открывают термос, достают из него флакон, осторожно перемешивают в нем сперму (путем вращения флакона), берут каплю спермы на исследо­вание, а флакон со спермой быстро помещают в термос со льдом. Если сперма сохранялась в одноразовых про­бирках или ампулах, то после извлечения их из термоса и смешивания спермы (вращательными движениями про­бирки или ампулы) приоткрывают пробку пробирки, у ампулы напильником надрезают шейку, ломают ее и сте­рильной пипеткой или стеклянной палочкой берут каплю спермы. После этого ампулу закрывают шариком из сте­рильной марли или ваты, а пробирку со спермой закрывают пробкой и помещают обратно в термос со льдом.

Каплю спермы наносят на предметное стекло и рядом с ней каплю 2,9%-ного раствора натрия лимоннокислого или 1%-ного раствора натрия гидрокарбоната, смеши­вают, накры-вают покровным стеклом и исследуют под микроскопом при температуре 38 — 40°С. Для этого мик­роскоп помещают в ящик-термостат, обогреваемый электрической лампой, или пользуются обогревательным столиком.

Каплю спермы хряка, сохраненной при температуре 16 — 20°С, для оценки наносят на предметное стекло, добавляют к ней каплю 2,9%-ного раствора натрия ли­моннокислого, накрывают покровным стеклом и исследу­ют под микроскопом при температуре 40 — 42°С через 3 — 5 мин после нагревания.

Замороженную сперму быка оценивают после оттаи­вания. Замороженную сперму в гранулах (по 0,1 — 0,2 мл) помещают в теплый (38—40°С) 2,9%-ный раст­вор натрия лимонно-кислого объемом по 1 мл, после чего берут каплю для оценки. Исследуют сперму при темпе­ратуре 38 — 40°С.

Гранулы замороженной спермы объемом 0,5 мл оттаи­вают во флаконе или пробирке, погруженных в воду температурой 38 — 40°С, и исследуют под микроскопом, как указано выше.

Для Оттаивания спермы в облицованных гранулах их извлекают из жидкого азота пинцетом и помещают в воду температурой 38 — 40°С на 5 — 10 с до появления тонкого стерженька льда. Оценку активности спермиев производят под микроскопом при температуре 38 — 40°С выборочно каждой новой партии спермы. Для этого вскрывают гранулу, наносят на предметное стекло каплю спермы, добавляют к ней изотонический раствор натрия лимоннокислого и исследуют. Если гранулы изготовлены из прозрачного материала, гранулу не вскрывают, а помещают ее на предметное стекло и прижимают край вторым стеклом и специальным зажимом, затем кладут на предметный столик микроскопа и определяют качество спермы перед осемене-нием.

Перед осеменением животных соломинки (пайетты) с замороженной спермой оттаивают (не более двух доз) в стерильном полиэтиленовом мешочке в водяной бане при температуре 38 — 40°С в течение 10 с. С одного конца соломинки (выборочно) стерильными ножницами среза­ют пробку и опускают этот конец соломинки в подогре­тый до 38 — 40°С изотонический раствор натрия лимонно­кислого (2,9%-ный). Затем этими же ножницами среза­ют другой его конец и оттаявшую сперму выливают во флакон. Полученную смесь спермы и раствора переме­шивают соломинкой и с ее помощью наносят каплю спермы на предметное стекло, производят оценку под микроскопом при температуре 38 — 40°С.

Для искусственного осеменения коров и телок заморожен-ную сперму после оттаивания допускают с оценкой активнос-ти спермиев не ниже 4 баллов.

Замораживание спермы жеребца. Перед заморажива­нием сперму жеребца оазбавляют в 4 раза лакто-хелато- цитратно-желточной (ЛХЦЖ) или лактозо-желточно-сульфатной (ЛЖС) средой.

Состав среды ЛХЦЖ: лактоза — 11 г, желток — 0,8 г, 4,2%-ный раствор двууглекислой соды — 0,2 мл, 35,7%-ный раствор цитрата натрия — 0,25 мг, хелатон — 100 мг, глицерин — 3,5 мл, вода дистиллированная — 100 мл.

Состав среды ЛЖС: лактоза — 10 г, сульфат аммиа­ка — 150 мг, желток — 1,6 г, глицерин — 3,5 мл, вода дистиллированная — 100 мл.

После разбавления сперму охлаждают до 0°С и вы­держивают при этой температуре 2 ч. Охлажденную сперму разливают в алюминиевые пакеты по 13 мл, за­крывают двойной закаткой и на их стенках карандашом или шариковой ручкой пишут кличку жеребца, породу, дату получения спермы. Пакеты со спермой заморажи­вают в охлажденном газе над жидким азотом в специальном устройстве, которое состоит из пенопластового поплавка, съемного держате­ля, в котором фиксируют па­кеты со спермой, и металли­ческого кольца-испарителя. На поплавок в держатели помещают пакеты со спермой (200 мл) и опускают его в сосуд Дьюара на поверхность жидкого азота.

Рис. 31. Схема замораживания спермы в сосудах Дьюара:

1 — пенопластовая пробка; 2 — направ­ляющий стержень; 3 — держатель — винтопластовый круг с четырьмя про­резями, в которых закрепляют пакеты со спермой; 4 — пенопластовый попла­вок; 5 — испаритель — спираль из алю­миниевой проволоки.

Поплавок позволяет автомати-чески дер­жать сперму на заданном расстоянии от поверх-ности жидкого азота. Сосуд Дьюара закрывают крышкой и через 5 мин пакеты с заморожен-ной спермой переносят в храни-лище с жидким азотом (рис. 31,).

Алюминиевые пакеты с замороженной спермой жереб­ца для оттаивания погружают на 1 — 2 мин в водяную баню при температуре 38 — 40°С. После оттаивания их вытирают стерильной марлей, обеззараживают 96%-ным спиртом, обрезают стерильными ножницами край пакета и пипеткой или стеклянной палочкой берут каплю спер­мы, добавляют к ней каплю 2,9%-ного раствора натрия лимоннокислого и оценивают активность спермиев под микроскопом. Подвижность спермиев в оттаявшей сперме должна быть не ниже 2 баллов.

Техника безопасности при работе с жидким азотом.

При работе с жидким азотом персоналу необходимо соблюдать правила техники безопасности. Работать нуж­но в защитных очках, кожаных рукавицах или перчат­ках. Попадание жидкого азота на незащищенные участ­ки кожного покрова вызывает ожог (обморожение). При попадании жидкого азота на открытый участок тела его необходимо немедленно смыть водой. При заливке жид­ким азотом неохлажденного сосуда нельзя заглядывать в его горловину, так как при этом может произойти выброс жидкости азота вследствие образования большого количества газа. Повышение концентрации азота в воздухе вызывает голов-ную боль, головокружение и даже потерю сознания. Поэтому помещения, где хранят жид­кий азот, оборудуют приточно-вытяжной или принуди­тельной вентиляцией. При обмороч-ном состоянии постра­давшего немедленно выносят на свежий воздух. Во время эксплуатации сосуда Дьюара нельзя плотно закрывать его горловину, так как при испарении жидкого азота и прекращении выхода газа в атмосферу будет созда­ваться повышенное давление внутри сосуда и он может взорваться. Сосуды Дьюара с жидким азотом при транс­портировании необходимо хорошо закреплять во избежа­ние их падения и возможного взрыва. При подготовке сосудов к перевозке авиатранспортом их заливают жид­ким азотом на половину гидравлической емкости. В це­лях предотвращения накопления взрывоопасной смеси в сосуде от обогащения жидкого азота кислородом произ­водят контроль его с помощью переносного газоанали­затора ГХП-3. Такой анализ проводят в хранилище раз в год, а в сосудах на пунктах — раз в 6 мес. После накопления кислорода в количестве 15% сосуд необхо­димо опорожнить в месте, очищенном от предметов органического происхождения: дерева, бумаги, тряпок (особенно промасленных), навоза и пр.

.