Методы стерилизации оборудования и питательных сред
Отличительной особенностью биотехнологии является принцип асептики (стерильности), решающий следующие задачи:
1) устранение посторонней микрофлоры из растворов до введения в них посевного материала;
2) поддерживание чистоты культуры на всем протяжении процесса выращивания;
3) стерилизация питательных сред, добавочных компонентов, титрантов, пеногасителей;
4) стерилизация подаваемого воздуха.
Основные методы стерилизации, используемые в биотехнологическом производстве представлены в таблице 1.
Наибольшее значение имеют термические методы для стерилизации оборудования и сред, а также фильтрационный – для удаления микроорганизмов из вводимого в биореактор воздуха или другого газа. Как правило, для стерилизации сред и аппаратуры используют влажную термическую обработку с использованием воды и пара. Такая обработка более эффективна, чем нагревание сухого биореактора. Чаще всего используют стерилизацию перегретым паром, вводимым под давлением непосредственно в аппарат или генерируемым в самом биореакторе. Если среда содержит белки, то реактор в этом случае стерилизуют отдельно, чтобы избежать пригорание содержащихся в питательной среде веществ на электронагревателе.
Таблица 1
Методы стерилизации, применяемые в промышленной биотехнологии
| Метод | Краткая характеристика | Область применения |
| 1.Термический | Нагревание объекта стерилизации | Основной метод стерилизации реакторов, сред, оборудования |
| а) острым паром | Пропускание струи пара в агрегат со средой | Стерилизация аппаратов и сред |
| б) глухим паром | Пар изолирован от стерилизуемых сред металлическими стена-ми (например, в змее-виках) | Стерилизация питательных сред и их компонентов |
| в) паром генерируе-мым в сосуде | Используются электро-нагреватели, которые вводят в стерилизу-емый объект | Стерилизация реакторов и сред |
| г) в автоклаве | Паром под давлением | Стерилизация сред, мелкого оборудования |
| 2. Химический | С применением дезин-фицирующих агентов (окиси этилена или пропилена, ß-пропио-лактона) | Стерилизация питательных сред |
| 3.Фильтрационный | Пропускание газов или жидкостей через мелко-пористые или волок-нистые фильтры, задер-живающие микроорга-низмы | Стерилизация воздуха (газа), жидких сред |
| 4.Радиационный | Обработка УФ- и иони-зирующими излуче-ниями | Не распространен |
Необходимо найти оптимальную температуру, при которой достигается высокая надежность стерилизации и в то же время сводятся до минимума энергозатраты и порча материала. Нагревание может вызвать химические превращения компонентов питательной среды. При 100ºС и выше карбонильные группы сахаров взаимодействуют с ионами аммония или аминогруппами аминокислот и белков. При этом образуются продукты, являющиеся ингибиторами роста клеток. Чтобы избежать этого, необходимо раздельно стерилизовать компоненты питательной среды.
Разложение ряда веществ, например, моносахаров и витаминов, вынуждают ограничить время и температуру для термической стерилизации, а иногда вовсе отказаться от нее. Поэтому применяют химические дезинфицирующие вещества или фильтрацию жидкостей. Фильтры, однако, быстро забиваются клетками микроорганизмов и другими взвешенными частицами.
Фильтрация воздуха или другого газа обычно обходится без частой смены фильтров, поскольку в них содержание взвешенных веществ меньше, чем в жидкой среде. Наиболее перспективны мембранные фильтры из тефлона с диаметром пор 0,2 мкм. Они эффективно задерживают частицы с размерами в 100 раз меньшими указанного диаметра пор. Это связано с броуновским движением частиц в воздухе, отклоняющим их от прямолинейной траектории, что обуславливает высокую вероятность столкновения со стенками пор, их адсорбцию.
В крупнотоннажных производствах питательные субстраты стерилизуют периодическим и непрерывным методом. При периодическом методе стерилизацию проводят в ферментере. Среду нагревают до температуры стерилизации (128-135ºС), выдерживают при данной температуре 20-30 минут и охлаждают до температуры ферментации. Экономически более выгоден непрерывный способ стерилизации. Нагревание среды проводят в колоннах, паровых эжекторах, теплообменниках. Длительность выдерживания среды должна гарантировать инактивацию вегетативных клеток и спор.
В лабораторных условиях для стерилизации оборудования и питательных сред применяют термические методы: автоклавирование, кипячение, пастеризацию, прокаливание.
Прокаливанием, или флашбированием, стерилизуют непосредственно перед употреблением бактериологические петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, пинцеты), а также стеклянные палочки, предметные , покровные стекла.
Стерилизацию сухим жаром применяют для обработки посуды и сухих материалов, например, мела, крахмала. Нагревание проводят в течение 2 часов при 170ºС в сухожаровых или электросушильных шкафах. Температура выше 170ºС не рекомендуется: ватные пробки и бумага начинают разрушаться. По окончании стерилизации шкаф открывают только после того как температура в нем снизится до комнатной, иначе под действием холодного воздуха стекло может лопнуть.
Стерилизация текучим паром (100ºС) обрабатывают предметы, портящиеся от сухого жара, и некоторые питательные среды, не выдерживающие более высокой температуры (среды с углеводами, молоко). Данную стерилизацию называют дробной и производят в течение трех дней (по 30 мин ежедневно) в кипятильнике Коха или на водяной бане. При однократном прогреве при температуре 100ºС за 30 мин погибают вегетативные клетки, споры микроорганизмов остаются жизнеспособными. После прогрева среду помещают на 24 часа в термостат при 28-30ºС. Споры, сохранившиеся при первом нагревании, успевают за это время прорасти в вегетативные формы, которые погибают при последующем нагревании. Операцию повторяют три раза.
Стерилизация насыщенным паром под давлением – наиболее быстрый и надежный способ термической стерилизации, при котором гибнут самые устойчивые споры. Таким образом стерилизуют большинство питательных сред. Этот способ основан на прогревании субстрата насыщенным паром под давлением выше атмосферного. Обработку насыщенным паром выполняют в герметично закрывающемся толстостенном котел - автоклаве. Автоклав представляет собой металлический двустенный аппарат (рис.2), внутренняя часть которого служит стерилизационной камерой (1), куда помещают стерилизуемый материал.
Рис.2. Схема автоклава. 1 - стерилизационная камера; 2 - кран для выхода воздуха; 3 - манометр; 4 - предохранительный клапан; 5 - водопаровая камера; 6 - воронка для заполнения автоклава водой; 7 - отверстие для поступления пара в стерилизационную камеру; 8 - крышка автоклава; 9 - подставка для стерилизуемого материала.
Стерилизационная камера снабжена краном (2) для выхода воздуха, манометром (3) для определения давления пара и предохранительным клапаном (4) для выхода пара при повышении давления сверх необходимого. Водонапорная камера (5) через воронку (6) заполняется дистиллированной водой до метки на водомерной трубке. Манометр показывает, на сколько давление пара внутри котла выше атмосферного. Показателям манометра в физических атмосферах соответствует определенная температура. Каждый микроорганизм имеет свой температурный оптимум. Споры микроорганизмов более терморезистентны и являются лимитирующим фактором, определяющим температурный режим стерилизации сред.
Компоненты питательных сред по-разному реагируют на термическое воздействие. Во избежание их нежелательных деструктивных изменений применяют по возможности более мягкие режимы стерилизации или раздельную стерилизацию компонентов.
Пастеризацияпредставляет собой неполную, или частичную, стерилизацию, что означает нагревание при 65-80ºС в течение 30 минут с последующим быстрым охлаждением до 10-11ºС.
Стерилизация фильтрованиемчерез мелкопористые фильтры применяют для обработки сред, компоненты которых легко разлагаются при нагревании. Через мелкие поры фильтра могут пройти только мелкие микроорганизмы (вирусы, бактериофаги).
Наиболее часто используют фильтры из коалина, представляющие собой полые целиндры, закрытые с одной стороны. Чтобы жидкость прошла через такой фильтр, необходимо создать разницу давления по обе стороны цилиндра. Этого достигают негнетанием или откачиванием воздуха при помощи масляных насосов. Фильтр соединяют с приемником для жидкой среды – колбой Бунзена. Оттянутый конец колбы закрывают ватной пробкой. Фильтр с приемником стерилизуют. Среду для стерилизации наливают в сосуд, в который помещают фильтр, а колба Бунзена с ватно-марлевой пробкой соединяют с насосом и выкачивают воздух. Жидкость под давлением проходит через фильтр в приемник. Бактерии остаются с внешней стороны фильтра. Неудобство метода заключается в медленной фильтрации и необходимости частой очистки фильтров.
ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ РАБОТЫ
1.Приготовить ватно-марлевую пробку для стерилизации флакона или пробирки.
2.Подготовить к стерилизации (завернуть в плотную бумагу) 4 чашки Петри. Запробковать и завернуть в бумажную полоску пипетки.
3.Приготовить по заданной преподавателем методике плотную питательную среду.
4.Простерилизовать приготовленную питательную среду на водяной бане дробным методом.
5.Приготовить стерильный 0,89% раствор хлорида натрия (физиологический раствор).
4. ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ВЫПОЛНЕНИИ ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЫ:
1) пробирки;
2) пипетки;
3) чашки Петри;
4) плотная бумага;
5) вата;
6) марля;
7) нитки;
8) воронка;
9) водяная баня;
10) весы технические;
11) кастрюля.
ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ
1) Соблюдайте правила работы в соответствии с общим инструктажем по технике безопасности в биотехнологической лаборатории;
2) Осторожно обращайтесь со стеклянной посудой;
3) Особую внимательность проявляйте при работе с водяной баней, находящейся на электроплите;
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Какие побочные продукты производства используются в биотехнологическом производстве?
2. Дать понятие питательной среды.
3. Перечислите виды питательных сред, используемых для выращивания микроорганизмов?
4. Каков состав агар-агара и желатины. их роль в процессе приготовления питательных сред?
5. Назовите методы стерилизации питательных сред.
6. Преимущества и недостатки термических методов стерилизации.
7. Процессы стерилизации и пастеризации. Достоинства и недостатки методов.
8. Особенности и применимость дробного метода стерилизации.
9. Обработка паром под давлением. Устройство автоклава.
10. Указать последовательность операций при использовании автоклава.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1.Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии.- М.: Колос, 1993.- 175 с.
2. Д. Уонд, Ч.Кооней, А.Демайн и др. Ферментация и технология ферментов.- М: Легкая промышленност,1983.-335с.
3. Микробиология / Под ред. Покровского. – М: Медицина, 2000.
4. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. – М.: Медицина, 1986. – 391 с.
5. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов.-М.: Агро-промиздат, 1987.- 335с.
Составители:
д.б.н., профессор ВолгГТУ Владимцева Ирина Владимировна;
к.х.н., доцент Хохлова Татьяна Васильевна;
к.т.н., ст. преподаватель Колотова Ольга Владимировна;
аспирант Федотова Лариса Валентиновна.
.
Методические указания к лабораторной работе по курсу «Основы биотехнологии» для студентов по направлению 5508 «Химическая технология и биотехнология»
Редактор
Темплан 2002 г., позиция №_____________
Подписано в печать ___________________Формат 60х84 1/16
Бумага газетная. Печать офсетная. Усл.печ.л._________
Уч.-изд.л.______.Тираж___________экз. Заказ № __________.Бесплатно.
Волгоградский государственный технический университет.
40131, Волгоград, пр. Ленина, 28.
Типография ВолгГТУ. 400131, Волгоград, пр. Ленина, 35