Гемопоэтические стволовые клетки.

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) определяются по их способности давать все гемопоэтические линии in vivo и поддерживать образование этих клеток в течение всей жизни человека. В отсутствие надежных прямых маркеров ГСК, их идентификация и подсчет зависят от функциональных и мультилинейных исследований репопуляции in vivo. Необыкновенно низкая встречаемость ГСК в любой ткани и отсутствие специфического ГСК фенотипа сделали их очистку и характеристику весьма трудной задачей. ГСК и примитивные гемопоэтические клетки могут быть отличимы от зрелых клеток крови по отсутствию у них линия - специфичных маркеров и присутствию некоторых других поверхностных антигенов, таких, как CD133 (для человеческих клеток) и c-kit и Sca-1 (у мышиных клеток). Функциональный анализ субпопуляций примитивных гемопоэтических клеток привел к созданию нескольких процедур для изоляции клеточных популяций, которые сильно обогащены клетками, проявляющими активность стволовых клеток in vivo. Упрощенные методы для получения этих клеток с высоким выходом были важны для практического использовании таких наработок /61/.

ГСК широко использовались для ауто и алло трансплантаций в течение десятилетий, хотя мало было известно об их миграции, выживании, самообновлении и дифференциации. Сортировка их по CD34(+) маркеру, который они экспрессируют на клеточной поверхности, привела к открытию ГСК в CD34(-) компартменте, что может предшествовать появлению CD34(+) ГСК в процессе дифференцировки. До недавнего времени стволовые клетки в костном мозге считали специфичными для гемопоэза. Эксперименты, включающие клинические испытания, показали образование различных тканей, например, мускульных, нервных клеток и гепатоцитов, после трансплантации медуллярных клеток и опровергнули эту догму. Фактически, доказательства такой трасдифференцировки ГСК все еще отсутствуют, и данные могут быть получены при изучении дифференцировки других мультипотентных клеток, присутствующих в костном мозге, таких, как мезенхимальные стволовые клетки и более примитивные мультипотентные взрослые зародышевые клетки и клетки побочной популяции /10/.

В последние годы стало очевидным, что хемокин SDF-1 и его рецептор CXCR4 играют пилотную роль в нормальном гемопоэзе. Они являются важными для нормального онтогенеза гемопоэза в течение эмбриогенеза и продолжают играть ключевую роль в сохранении гемопоэтических прогениторных клеток в микроокружении костного мозга у взрослых. В сязи с этой роли прерывание взаимодействий SDF-1/CXCR4 приводит к мобилизации гемопоэтических прогениторных клеток, а стандартный протокол мобилизации препятствует им. Сходно, взаимодействия SDF-1/CXCR4 требуются для хоуминга и приживления трансплантанта во время трансплантации. SDF-1 регулирует локализацию лейкемических клеток, и, как их нормальные двойники, большинство лейкемических клеток отвечают на SDF-1 увеличенными адгезией, выживанием и пролиферацией. Однако в некоторых случаях ответы лейкемических клеток на SDF-1 могут быть разрегулированы, а влияние этого на прогрессирование болезни неизвестно /25/.

Было показано, что стволовые клетки из различных тканей способны дифференцироваться в клетки, характерные для отдельных тканей, по-видимому, в ответ на сигналы микроокружения. Это иерархическая пластичность. Показано, что как человеческие, так и мышиные клетки из нейросферы, имеющие потенциал дифференцироваться в нейроны, олигодендритные клетки и астроциты, продуцировали гемопоэтические стволовые клетки при пересадке в 3,5 дневные бластомеры овцы или мыши. Также продемонстрирована альтернативная форма пластичности стволовых клеток: функциональная пластичность на различных точках в клеточном цикле и на различных фазах циркадного ритма. Показано, что длительная пересадка обратимо варьирует по мере того, как примитивные мышиные стволовые клетки (линейные – негативные к родамину и Hoechst) переходят в клеточный цикл после стимуляции интерлейкином-3, ИЛ-6, ИЛ-11 и стальным фактором. Приживление трансплантанта дефектно в поздней S/ранней G2. Приживление транспланттанта заметно меняется вместе с циркадным ритмом. Предполагаемые механизмы для этих фенотипических сдвигов включают изменения в экспрессии белков адгезии с последующими изменениями в хоуминге в костный мозг. Показано, что дифференциация стволовых клеток заметно меняется в зависимости от фазы клеточного цикла. Имеются другие свойства гемопоэтической стволовой клетки, которые заставляют предположить, что это высокопластичная клетка обладает способностью быстро изменять свой мембранный фенотип и проявляет необычную направленную подвижность. Следовательно, пластичность, вызванная фазами клеточного цикла и циркадного ритма, должна быть рассматриваема, как важнейшая дополнительная черта фенотипа гемопоэтических стволовых клеток /46/.

Нормальный устойчивый гемопоэз происходит в микроокружении костного мозга. Растворимые факторы, также как контактные взаимодействия между гемопоэтическими клетками и микроокружением костного мозга, диктуют судьбу гемопоэтических клеток и прогениторных клеток. В последние десять лет стало ясно, что клетка-клетка и клетка - экстраклеточный матрикс взаимодействия через рецепторы адгезии играют главную роль в гемопоэтическом процессе. Они необходимы для резиденции стволовых клеток, так же, как и для хоуминга стволовых клеток и прогениторных клеток в костном мозге в месте поселения клеток трансплантанта стволовых клеток. Более того, рецепторы адгезии играют важную роль в регуляции поведения клеток, либо через прямую активацию сигнальных путей, важных для выживания клеток, клеточного роста и судьбы клеток или модулировании ответов на факторы роста. Понимание механизмов ненормальностей, видимых в этих взаимодействиях при болезнях гемопоэтической системы, поможет развить лучшие терапевтические стратегии, основанные на патогенезе этих болезней /45/.

ГСК являются привлекательной мишенью для генной терапии генетических болезней иммунной и гемопоэтической систем, и для лекарство – резистентных стратегий, в которых гены, ответственные за резистентность к различным хемотерапевтическим агентам, преобразовываются. Стволовые клетки относительно легко получить пункцией костного мозга или мобилизацией с помощью G-CSF в периферическую кровь, и обогатить с помощью анти - CD34 + моноклональных антител. Для обычной ретровирусной трансдукции нормальные покоящиеся ГСК должны быть активированы в клеточный цикл путем использования соответствующих цитокинов, и было критически важным найти комбинацию цитокинов, которые сохраняют способность к самообновлению на длительный период репопулирующих ГСК. Стало очевидным, что стратегии оптимизирующие ГСК цикл и провирусную интеграцию могут уменьшить способность трансдуцированных ГСК конкурировать in vivo против эндогенных ГСК или ГСК, которые не были активированы в клеточный цикл. Вирусные векторы могут интегрировать гены в неделящиеся клетки, но возрастает эффективность трансдукции, если ГСК активированы в G1-фазу клеточного цикла. Эта уменьшенная эффективность длительной трансплантации ГСК может быть связана с нарушенным самообновлением или уменьшенной эффективностью хоуминга в костный мозг. Последняя может быть связана с уменьшением модуляции хемокиновых рецепторов, необходимых для хемотактического хоуминга в костный мозг. В качестве альтернативы или дополнения, возможно, существуют уменьшение модуляции: (1) молекул адгезии ГСК, необходимых для адгезии к эндотелию и выхода из циркуляции; (2) металлопротеиназ, секретируемых ГСК, которые способствуют миграции через экстрацеллюлярный матрикс и обеспечивают критические растворимые факторы в микроокружении костного мозга. Более противоречивый взгляд заключается в том, что ведущие к смерти клеток пути, например, те, которые включают FasR (CD95), могут быть активированы находящимися в клеточном цикле ГСК, в результате чего наступает их селективная деструкция при трансплантации и локализации в сайтах, богатых Fas лигандами, таких, как печень /39/.

Ex vivo экспансия гемопоэтических предшественников, прогениторных клеток и стволовых клеток представляют современную эру клеточной терапии в 21 веке. В течение последних 10 лет развитие способов идентификации и очистки гемопоэтических стволовых клеток и цитокинов способствовали улучшению ex vivo технологий экспансии стволовых клеток. Однако технология пока не достигла такой стадии, когда размножившиеся ex vivo гемопоэтические прогеиторные и стволовые клетки могут рутинно использоваться для заместительной терапии. Уроки, полученные в последние 10 лет при исследованиях, сосредоточеных на развитии оптимальной ex vivo экспансии стволовых клеток, привели к гораздо лучшему пониманию биологии стволовых клеток. Это знание привело к новым попыткам ex vivo экспансии гемопоэтических предшественников, прогениторных клеток и стволовых клеток и должно привести к нового покаления клеточных терапий. Три области ex vivo экспансии стволовых клеток, которые определяют их клиническую осуществимость, включат в себя:(1) выбор оптимальной популяции стволовых клеток для экспансии;(2) определение желательных характеристик популяции стволовых клеток в состоянии экспансии, которые могут быть использованы при трансплантации;(3) развитие новых реагентов и процедур для экспансии и инфузии гемопоэтичесих прогениторных клеток и стволовых клеток /50/.

Поддержание зрелых клеток крови требует присутствия гемопоэтических стволовых клеток, характеристиками которых являются способность к самообновлению и образование дифференцированного потомства. Предлагается стохастическая модель для механизма самообновления и дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток с использованием in клональной культуральной техники in vitro. Недавний прогресс в молекулярной биологии способствовал изоляции и получению характеристик некоторых цитокинов (IL-1, IL-3, IL-6, IL-11, G-CSF и фактор стволовых клеток factor (SCF)) /42/.

Таким образом, гемопоэтические стволовые клетки способны образовывать не только клетки крови, но и другие типы клеток. В настоящее время создаются способы увеличивающие выход ГСК из костного мозга. ГСК являются важнейшим источником получения собственных стволовых клеток.

3.3.Мезенхимальные стволовые клетки.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были изолированы из костного мозга, надкостницы, трабекулярной кости, жировой ткани, синовиальной оболочки, скелетной мускулатуры и молочных зубов. Эти клетки обладают способностью дифференцироваться в клетки соединительной ткани, включая кость, жир, хрящ и мускулатуру. Много было выяснено в последние годы об изоляции и характеристиках МСК и о контроле над их дифференцировкой. Эти клетки вызвали большой интерес из-за перспектив их использования в регенеративной медицине и тканевой инженерии. Существуют драматические примеры, взятые из преклинического и клинического использования МСК, которые иллюстрируют их терапевтическую ценность. По мере того, как развивались новые методы, выявлено несколько аспектов взаимодействий имплантированных клеток с хозяином. Они должны быть рассмотрены перед тем, как понять лежащие в их основе механизмы. Взаимодействия м\имплантированных клеток с хозяином включают иммунный ответ хозяина на имплантированные клетки, механизмы хоуминга, которые направляют клетки к месту повреждения, и дифференциация in vivo имплантированных клеток под влиянием локальных сигналов /4/.

Популяции стволовых клеток найдены в большинстве взрослых тканей и в обшем их дифференцирочный потенциал может отражать локальные клеточные популяции. Были описаны гемопоэтические, эпидермальные, мезенхимальные, невральные и гепато - стволовые клетки были. Возможно, что во взрослом организме эти клетки являются резервуаром репаративных клеток, которые мобилизуются повреждением и мигрируют в рану, где в кооперации с локальными клетками участвуют в репаративном ответе. Мезенхимальные стволовые клетки, изолированные из костного мозга, имеют способность дифференцироваться в клетки соединительной ткани. Некоторые разительные примеры терапевтического использования МСК были недавно описаны для таких случакв, как коронарная болезнь артерий, повреждение спинного мозга, болезнь Паркинсона и регенерация печени. В ортопедической медицине МСК применялись для восстановления костей и хряща и при лечении остеоартрита. Вопрос о реакции хозяина на имплантированные МСК становится критическим по мере развития клинических приложений. Есть несколько аспектов взаимодействий имплантированных стволовых клеток с хозяином, которые нужно рассмотреть для понимания механизмов, лежащих в основе терапии стволовыми клетками. Это (1) иммунный ответ хозяина на имплантированные клетки, (2) механизмы хоуминга, которые направляют клетки к месту повреждения, (3) дифференциация имплантированных клеток под влиянием локальных сигналов /3/.

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются предшественниками всех клеток соединительной ткани. МСК были изолированы из костного мозга и других тканей у взрослых множества видов позвоночных. Они размножались в культуре и диффренцировались в несколько ткань – образующих клеток, таких, как кость, хрящ, жир, мускулатура, сухожилие, печень, почки, сердце, даже клетки мозга. Последние достижения в практическом применении МСК при регенерации человеческого суставного мыщелока синовиального сустава являются примерами их функциональности и многосторонности /1/.

Таким образом, мезенхимальные клетки при дифференцировке образуют различные клетки соединительной ткани.