Производство ферментов медицинского назначения. Создание ферментов с помощью методов генной инженерии. Производство биосенсоров на основе ферментов.

Применение ферментных препаратов в медицине. Ферментные препараты используют для растворения тромбов, лечения наследственных заболеваний, удаления нежизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых фрагментов, освобождение организма от токсических веществ. Яркий пример – спасение жизни больных с тромбозом конечностей, легких, коронарных сосудов сердца при помощи тромболитических ферментов – стрептокиназы, урокиназы. В настоящее время созданы и иммобилизованные формы таких ферментов.

В современной медицине протеазы применяются для очистки очагов гнойно-некротических процессов от патологических продуктов, а также для лечения ожогов. Лечение рака L-аспарагиназы, которая лишает раковые клетки ресурсов необходимого для их развития аспарагина, поступающего с током крови.

Известно около 200 наследственных заболеваний, обусловленных дефицитом ферментов. В настоящее время делают попытки лечения этих заболеваний с применением ферментов. Так, пытаются лечить болезнь Гоше, при которой организм не способен расщеплять глюкоцеребрезиды.

Применение ферментов в тонком органическом синтезе оправдано, прежде всего, в тех случаях, когда молекулы, подлежащие химической перестройки достаточно сложны, содержат близкие по своим свойствам химические связи, из которых затрагиваться должна только одна (или лишь некоторые из них). Поэтому ферменты незаменимы при синтезе производных стероидов, алкалоидов, простагландинов и других природных веществ сложной структуры.

Например, молекулы бензилпенициллина содержит две связи СО-N, одна из которых расположена в боковой цепи, а другая входит в состав четырехчленного цикла. Воздействовать на одну из этих связей чисто химически, не затронув другую, практически невозможно; а вот фермент пенициллинамидаза способен отщеплять боковую цепь, совершенно не затрагивая цикла.

Модификация алкалоида тропана: фермент химотрипсин атакует только одну из двух сложноэфирных связей молекулы этого вещества, обладающих с точки зрения химика, примерно одинаковой реакционной способностью.

Многие ферменты способны отличать не только похожие химические связи, но и делать однозначный выбор между молекулами изомеров, отличающихся друг от друга лишь как предмет и его отражение в зеркале. Эта стереоспецифичность ферментного катализа дает возможность получать чистые зеркальные изомеры, обладающие различным физиологическим действием. Например, для получения некоторых психотропных препаратов необходим один из зеркальных изомеров 3-хлор-2-метилпропанола, но в результате химического синтеза образуется сложный эфир, представляющий собой смесь равных количеств «левых» и «правых» молекул, но если этот эфир гидролизировать при помощи фермента липазы, то эфирная связь расщепляется только у «левых» молекул и продукт легко отделяется от исходного вещества. Подобный метод применяется и в других аналогичных случаях, например, для получения зеркальных изомеров аминокислот.

Технология рекомбинантных ДНК позволила проводить перемещение генов, ответственных за синтез полезного фермента, из одного организма в другой, т. е., когда фермент проявляет свойства, важные для промышленного использования, соответствующий ген можно клонировать в более подходящем микроорганизме-«хозяине» и затем провести промышленную ферментацию.

Таким методом становится возможным производить промышленные ферменты очень высокого качества и чистоты. Недавний пример этой технологии - получение моющего фермента липолазы, улучшающий удаление жирных пятен на тканях. Фермент был вначале обнаружен при росте плесени Humicola languinosa в количестве, не соответствующем для промышленного производства. Далее, фрагмент ДНК (ген), кодирующий фермент, был клонирован в продукты роста плесени Aspergillus oryzae и начал производиться на промышленном уровне. Фермент оказался эффективным при различных моющих условиях, а также очень устойчивым при разных температурах и pH.

Белковая инженерия или «молекулярная хирургия» использовалась для изменения свойств молекул ферментов. Белковая инженерия ферментов включает создание трехмерной графической модели очищенного фермента, полученного методом рентгено-структурного анализа. Можно считать, что изменения в структуре фермента, приводящие к большей стабильности при изменении, например, pH и температуры, сделаны с помощью замен участков гена, кодирующего фермент, на молекулярном уровне.

Имеются два главных подхода для изменения функции ферментов. Первый - мутагенез клонированного продукта: аминокислотные остатки в определенном положении в структуре фермента можно заменить другими подходящими закодированными аминокислотными остатками. Измененный ген далее трансформируется в подходящий организм «хозяина», и производится мутантный фермент. Этот процесс известен как «мутагенез направленного участка». Второй используемый метод включает выделение природного фермента и модификацию его структуры химическими или ферментными методами, иногда этот метод называется химической мутацией. Недавний успешный пример белковой инженерии - модификация фермента фосфолипазы, который был изменен для того, чтобы он мог работать при более высоких концентрациях кислоты. Этот фермент широко используется как эмульгатор в пищевой промышленности.

Биосенсоры - это аналитические устройства, использующие биологические материалы для «узнавания» определенных моле­кул и выдающие информацию об их присутствии и количестве в виде электрического сигнала. Принцип анализа, реализуемый в биосенсорах, основан на том, что биоматериал (ферменты, клет­ки, органеллы, иммунокомпоненты), иммобилизованный на физических датчиках, при взаимодействии с анализируемыми со­единениями генерирует зависимый от концентрации сигнал, ре­гистрируемый преобразователем.

Идея создания такого рода устройств возникла сравнительно недавно, в 60-х годах XX века. Впервые ее высказали Кларк и Лионе в 1967 г. Идея Кларка состояла в использовании фермент­ного электрода, т.е. электрохимического датчика с иммобилизо­ванным на его поверхности ферментом. Затем в обиход вошло понятие «биосенсор» или «биочип». Это важное событие к нау­ке. Здесь отражаются глубокие причины, связанные с так назы­ваемыми интеграционно-синтетическими процессами в науке, приводящими к появлению новых знаний.

Большинство биосенсоров ориентированы на анализ биологи­ческих жидкостей. Действительно, например, в крови находятся тысячи различных соединений. Задача заключается в том, чтобы быстро и эффективно (количественно) определить концентрацию нужного соединения, например, глюкозы. Для людей, страдаю­щих диабетом, это жизненно важный клинический анализ. Био­сенсоры обеспечивают такую возможность.

Функционально биосенсоры сопоставимы с датчиками живо­го организма — биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в элек­трические. Наибольшее распространение сейчас получили био­сенсоры на основе ферментов, Среди таких устройств различают субстратные и ингибиторные биосенсоры. С их помощью реша­ют различные медико-биологические задачи (например, опреде­ление сахара в крови) и контролируют состояние среды обитания (контроль содержания токсикантов). Чувствительность ингиби­торных биосенсоров чрезвычайно высока, например, возможно определение остаточных количеств некоторых пестицидов на уровне 0.01 мкг/л и меньше.

Принципы конструирования биосенсоров . Конструктивно любой биосенсор представляет комбинированное устройство, состоящее из двух принципиальных функциональных элементов: биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с другом. Биохимический элемент представляет собой биоселектирующую структуру и выполняет функцию биологического элемента распознавания. В качестве бкохимического преобразователя используют все типы биологических структур: ферменты, антитела, рецепторы, нуклеиновые кислоты и даже живые клетки. Физический преобразователь сигнала, на­зываемый трансдьюсер, преобразует определяемый компонент, а точнее, концентрационный сигнал, в электрический. Для счи­тывания и записи информации используют электронные системы усиления и регистрации сигнала.

Трансдьюсерами могут быть электрохимические преобразо­ватели (электроды), различного рода оптические преобразовате­ли, гравитационные, калориметрические, резонансные системы. Все виды биоселектирующих элементов можно комбинировать с

различными трансдьюсерами. Это создает большое разнообразие различных типов биосенсоров.

Основными характеристиками, позволяющими биосенсорному анализу успешно конкурировать с традиционными методами, являются оперативность анализа, высокая специфичность и чув­ствительность при низкой стоимости, отсутствие необходимости использовать дорогостоящую аппаратуру и квалифицированный персонал.

Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойст­вами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по составу смеси, не прибегая ни к каким Дополнительным операциям, связанным с использованием дру­гих реагентов, концентрированием и т.д. (отсюда и название безреагентные методы анализа). Существует большое разнообра­зие физических преобразователей: электрохимические (электро­ды), спектроскопические (оптроды), пьезоэлектрические и т.д.

Разработка биосенсоров относится к наукоемким технологиям и представляет одну из ветвей современной биотехнологии. В настоящее время существует несколько типов биосенсоров. Наи­большее развитие получили ферментные и клеточные биосенсо­ры. Например, ферментные электроды, ферментные микрокало­риметрические датчики, биодатчики на основе хеми— и биолю­минесценции.

Ферментные (или безреагентные) электроды – используют электрохимический способ определения веществ, образующихся в ходе ферментативного превращения. Представляют собой электрод с нанесенным поверхностным слоем (каким-либо при­родным полимером), содержащим один или несколько иммоби­лизованных ферментов (иногда фермент может находиться в растворимом состоянии в приэлектродном слое, окруженном мембраной). В зависимости от типа взятого за основу электрода подразделяются на потенциометрические и амперометрические.

Ферментные микрокалориметрические датчики - использу­ют тепловой эффект ферментативной реакции. Состоит из двух колонок (измерительной и контрольной), заполненных носите­лем с иммобилизованным ферментом и снаряженных термисто-рами. При пропускании через измерительную колонку анализи­руемого образца происходит химическая реакция, которая со­провождается регистрируемым тепловым эффектом. Данный тип датчиков интересен своей универсальностью.

Хеми- и биолюминесцентные датчики — регистрируется све­товое излучение с различной длиной волны, испускаемое про­дуктами ферментативной реакции, находящимися в возбужден­ном состоянии. Конструкция включает колонку с иммобилизо­ванными на носителе ферментами (люциферазой, пероксидазой) и светоприемное устройство. Заложенный в систему этого типа датчиков аналитический метод характеризуется, прежде всего, крайне высокой чувствительностью — позволяет определять фем-томольные (10-12М) количества вещества.

Клеточные биосенсоры . Одно из достижений биотехнологии связано с развитием методов включения живых клеток в полимеры и твердые носители различной природы, и применение та­кого рода материалов для решения задач медицины, управляемо­го биосинтеза, анализа. Иммобилизованные клетки обладают рядом удивительных свойств.

Клетки являются доступным биологическим материалом. Используют клетки растений, животных, человека, ко наи­большее применение нашли клетки микроорганизмов, ко­торые культивируются, легко воспроизводятся и поддер­живаются в чистой культуре. В отличие от ферментов при использовании клеток не требуется дорогостоящих стадий очистки.

Имеющиеся методы иммобилизации: позволяют получить клетки, сохраняющие около 100% активности ферментов и способные функционировать достаточно длительные про­межутки времени. Клетки сохраняют все наиболее важные структуры и проявляют большую стабильность. В некото­рых случаях клетки сохраняют жизнеспособность и актив­ность ферментных систем в течение нескольких лет.

Клетки сохраняют, как правило, все системы жизнеобеспе­чения. Это позволяет проводить сложные последователь­ные реакции, осуществляя многостадийные процессы.

Для многих типов клеток, особенно микробных, разрабо­таны эффективные методы генетических операций, даю­щие возможность получать мутанты с высоким содержа­нием того или иного белка или фермента, что дает воз­можность оперировать с высокоэффективными каталити­ческими системами. Поскольку клетки сохраняют аппарат биосинтеза белка, потенциально могут быть разработаны высокоэффективные методы генодиагностики. Основными недостатками этих биосенсоров являются мед­ленный отклик электрода, связанный с необходимостью исполь­зовать толстые мембраны, а также сравнительно низкая селек­тивность, обусловленная присутствием в клетке или тканях не­скольких ферментных систем.

Для создания клеточных биосенсоров используют различные физические трансдьюсеры: электрохимические (амперометриче-ские, потенциометрические), оптические, акустические, калори­метрические. Развитие получили биосенсоры с использованием техники LAPS (светоадресуемых потенциометрических сенсо­ров). На основе LAPS-системы созданы достаточно чувствитель­ные системы слежения за физиологическим состоянием отдель­ных клеток - так называемые микрофизиометры.

Вопросы для самоконтроля:

1. Какие требования предъявляются к штаммам-продуцентам?
2. Как осуществляется производство ферментаных препаратов?\
3. Что такое инженерная энзимология?
4. Какие существуют методы иммобилизации объектов?
5. Создание фермента с помощью методов генной инженерии.
6. Способы создания биосенсоров на основе фермента?

Тезисы лекции № 7