Получение препаратов с индексом П10х и Г10х
В качестве примера можно представить технологический процесс получения препарата прототерризина П10х. Готовую культуру Asp. terricola штамм 3374 для очистки от балластных веществ направляют на диффузионную батарею. Получаемая диффузионная вытяжка содержит около 10% СВ, концентрация протеолитических ферментов составляет 0,25-0,28 ед./мл.
Процесс экстракции в диффузионной батарее проводят в таком режиме, чтобы отбор вытяжки составлял примерно 300% от массы абсолютно сухой культуры гриба, предназначенной для экстракции. Потери протеолитических ферментов не превышают 25%. Очистку ферментного экстракта от балластных веществ проводят на непрерывно действующих сепараторах. Перед подачей на сепаратор в вытяжку добавляют раствор аммиака и доводят pH до 8,4-8,6. На стадии сепарирования удается отделить до 6% балластных веществ от общего содержания СВ в вытяжке, потери протеолитических ферментов составляют не более 1%. Из сепаратора фугат направляют на непрерывно действующую установку, где к нему добавляют уксусную кислоту с тем, чтобы pH осветленной вытяжки довести до значения 6,0-6,2, и этанол концентрацией 96% об. Для осаждения ферментов могут быть использованы и другие органические растворители: метанол, ацетон, изопропанол.
Способ выделения ферментов из водных растворов органическими растворителями принято считать более эффективным по сравнению с высаливанием, т. к. он менее сложен, а растворители легко регенерировать перегонкой. Действие органических растворителей основано на снижении диэлектрической постоянной среды. Известно, что силы электростатического притяжения и отталкивания обратно пропорциональны диэлектрической постоянной. При смешивании водной вытяжки ферментов со спиртом происходит уменьшение этой постоянной, что способствует взаимодействию белковых молекул. Они теряют растворимость, образуют агрегаты и выпадают в осадок.
Осаждение ферментов проводят либо в реакторах периодического действия, либо в непрерывном потоке, регулируя ротаметрами объемы смешиваемых жидкостей. Чтобы сократить потери ферментов при смешивании экстракта с растворителем, осаждение проводят при пониженных температурах. Этанол перед подачей в установку охлаждают до - 5-8°С, а водную вытяжку - до 5-6 °С. Для отделения ферментного осадка от водно-спиртовой смеси применяют центрифугирование. Полученный осадок смешивают в смесителе с двумя объемами 96%-ного этанола на единицу массы осадка с целью промывки и дальнейшего обезвоживания. После центрифугирования осадок влажностью 30-35% направляют на сушку, которая ведется в вакуум-сушильных аппаратах периодического действия или в распылительных и сублимационных сушилках. Длительность периодической сушки (8-16 ч) зависит от температуры сушки и конечной влажности осадка. По достижении осадком влажности 10-13% сушку прекращают. Сухой продукт измельчают, смешивают с наполнителем до получения стандартной активности. Стандартный препарат фасуют по 0,5 кг в полиэтиленовые мешки, которые укладывают в жестяные коробки.
Для получения очищенных ферментных препаратов с индексом Г10х (на примере получения препарата пектаваморина Г10х) культуральную жидкость отделяют от биомассы. Биомасса поступает на сушку при температуре греющего воздуха 300-350 °С. Выход биомассы из 1 м3 культуральной жидкости составляет 100 кг при содержании сухих веществ 15%. Потери ферментов на этой стадии не превышают 5%. Полученный фильтрат культуральной жидкости упаривают до 1/7 первоначального объема, в результате содержание СВ в концентрате увеличивается с 2 до 12,5%. При концентрировании раствора ферментов наблюдается выпадение неактивного осадка. Потери ферментов на этой стадии не превышают 10%. Концентрат культуральной жидкости освобождают от неактивного осадка на сепараторах. Для осаждения пектолитических ферментов используют охлажденный до 4-6°С фугат концентрата с содержанием 12,5 % СВ. В качестве осадителя ферментов применяют охлажденный до температуры - 4-10 °С этанол. Осаждение проводится при концентрации спирта в смеси 76% об. при соотношении объемов концентрата культуральной жидкости и этанола 1:4,5. Полученная водно-спиртовая смесь подается на сепаратор. Ферментный осадок, полученный после сепарации, растворяют в трех объемах воды, а затем стандартизуют бентонитом или желатином, применяемыми в качестве наполнителя. Количество наполнителя рассчитывают с учетом активности концентрата, готового продукта и потерь в процессе сушки стандартизованного ферментного раствора.
Полученный полупродукт направляют в распылительную сушилку. Ферментный осадок сушат при температуре теплоносителя на входе в сушилку 160 °С и на выходе из сушилки 60-75 °С. Режимы сушки обеспечивают достижение 8%-ной влажности материала. На этой стадии потери ферментов составляют 5-8%.
Высушенный и стандартизованный до пектолитической активности 3000 ед./г (по медному методу) препарат фасуют по 0,5 кг в полиэтиленовые мешки, которые упаковывают в жестяные коробки. Отделенный на сепараторе отработанный этанол направляют на ректификацию, где его крепость доводят до 96,5% об. Потери спирта при ректификации составляют 1%.
Выделение препаратов с помощью органических растворителей в ряде случаев позволяет фракционировать комплекс ферментов. Например, разработан способ разделения амилолитического и протеолитического комплекса гриба Asp. oryzae методом фракционного осаждения диализованных ферментных экстрактов органическими растворителями.
Наиболее четкое разделение амилазы и протеазы происходит при температуре 0°С, pH 5,1. При концентрации этанола в смеси 48-52% протеаза осаждается почти полностью, а амилаза - только на 10%. После отделения осадка протеазы концентрацию этанола повышают до 70-74%, при этом выпадает амилаза со следами протеазы. Освобождение второй фракции от остатков протеазы проводят обработкой 5% бентонита при pH раствора 4,5. Из таких высокоочищенных препаратов можно получать кристаллические ферменты.