Гены любых микроорганизмов и патогенных в том числе, можно по их функциям разделить на две категории: есть так называемые «house kеeping genes» и «ivi genes».

Чтобы облегчить механизм расшифровки и идентификации генов американскими учеными была разработана специальная система, которая называется «IVET», дословно - «IN VIVO EXPRESSION TECHNOLOGY». Иногда эту систему называют – «методом захвата чужого промотора».

После геномики появилось понятие протеома (заметьте, не протеин, а протеом). Протеом – это совокупность всех белков клетки в данный момент (мгновение) на данном цикле развития клетки или на данном цикле ее ответа на внешнее воздействие. В общем - это, так сказать, мгновенная фотография клетки на любом ее физиологическом уровне. Желательно, чтобы на этой как бы фотографии было бы как можно больше белков. Иногда, - это тысячи белков, в редких случаях, даже десятки тысяч. Каким же образом улавливать эти тысячи белков? Существуют определенные методы, например, метод двухмерного электрофореза (т.е. разделение белков в одном направлении по молекулярной массе, а в другом - по изоэлектрической точке). Таким путем вы решаете основную задачу, допустим, вы нашли ген у микроорганизма (у патогена), но этот ген может и не экспрессироваться (т.е. не работать). А уж если вы нашли белок, то он обязательно будет «работать».

Есть также и количественная протеомика, т.е. протеомика как таковая отражает не только качественные параметры - какие белки есть в клетке; но и количественные, то есть увеличение или уменьшение количества белков в клетке.

Лекция №5

Биосинтез биологически активных веществ в условиях промышленного производства.

План лекции

1. Классификация биотехнологических производств.

2. Слагаемые биотехнологического процесса.

а) основные этапы

б) подготовительные стадии

3. Питательные среды

4. Защита биообъектов.

5. Конструкция ферментёра.

а) особенности устройства ферментёра

б) типы ферментёров

6. Классификация процессов ферментации.

а) фазы роста культуры

б) поверхностное культивирование

в) глубинное культивирование

Биотехнологическое производство различается как по степени сложности, так и по протяженности технологического процесса.

Существует быстрое производство, когда конечным продуктом является биомасса, которая может быть использована для производства, например, пероральных препаратов широко применяющихся при бисбактериозах: бифидум-бактерин, линекс и т.д. Медленное (растянутое во времени) биотехнологическое производство. Основным конечным продуктом такого производства является субстрат для получения лекарственных препаратов, ну например, для парентерального введения (инъекционным путем).

Биосинтез БАВ - это многостадийный процесс, в котором центральной операцией является биосинтез (ферментация). В результате, происходит образование целевых продуктов – субстанций для производства лекарственных препаратов и диагностикумов. Также нужно сказать, что для успешного проведения биосинтеза необходимо проведение подготовительных операций, иногда достаточно сложных. К числу таковых относятся:

-подготовка посевного материала: т.е. высеивание, выращивание и накопление биомассы до необходимых объемов, которое осуществляется в так называемых инокуляторах (посевных аппаратах).

Чтобы осуществлялся процесс биосинтеза, необходимо чтобы он протекал в стерильных условиях. Здесь, отдельно стоит проблема защиты биообъекта. Для того чтобы биообъект эффективно синтезировал целевой продукт, необходимо создать оптимальные условия его жизнедеятельности. Для этого биообъект изолируют от контакта с другими микроорганизмами в целях предотвращения конкуренции. Это достигается путем создания стерильных условий. Для стерильности процесса необходимо стерилизовать и очищать технологический воздух, а также проводить стерилизацию и герметизацию оборудования (ферментер, трубопроводы и т.д.). В основном, биотехнологические процессы происходят в аэробных условиях. Технологический воздух выполняет в биотехнологическом процессе не только питательные функции - аэрация, но и транспортные - перемещение жидкостей и взвесей в ферментере. Так как большинство микробиологических производств основано на использовании аэробного процесса, то мы будем говорить о необходимости получения стерильного воздуха, который стерилизуется только методом фильтрования.

Наконец, обязательно должна быть проведена стерилизация питательных сред. Понятие «среда для культивирования» включает не только опреде­ленный качественный и количественный состав компонентов или от­дельных элементов, необходимых для конструктивного и энергетиче­ского обмена организма (источники азота, углерода, фосфора, ряда микроэлементов, витамины, ростовые вещества), но и физико­-химические и физиологические факторы (кислотность, окислительно-­восстановительный потенциал, температура, аэрация и др.). Все эти факторы играют существенную роль в развитии микроорганизмов и в проявлении ими отдельных физиологических и биохимических функ­ций. Обычно изменение одного из этих факторов среды влечет за собой измене­ние других. Значительного повышения выхода целевого продукта обра­зуемого микроорганизмами достигают, используя методы математиче­ского расчета соотношения компонентов субстрата и их свойства.

Конструкция ферментёра должна обеспечивать максимальные условия для роста и жизнедеятельности микроорганизмов (тепло и массообмен). Ферментёры представляют собой закрытые цилиндричесие сосуды из нержавеющей стали огромной емкости объемом до 200 куб.м., снабженные специальными устройствами для подачи и диспергирования воздуха в питательной среде, так называемые аэраторы или барботёры. В ферментере обязательно есть устройства для нагревания и охлаждения - теплообменники (терморубашки).

Ферментер заполняется культуральной жидкостью на 2/3 объема.

По способу перемешивания и аэрации биореакторы под­разделяются на аппараты с механическим, пневматическим и циркуляционным перемешиванием.

Поверхностная ферментация на жидких питательных средах, в основном, осуществляется при культивировании растительных клеток для получения БАВ. Наиболее показательный пример – каллусное культивирование.

Теперь глубинная ферментация. При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешен­ном состоянии.

Периодический процесс - это самый простой, но в тоже время не самый продуктивный способ ферментации, при котором сначала ферментер полностью загружается, а затем запускается процесс ферментации.

Полупериодический процесс - это уже управляемый процесс ферментации. Здесь уже можно вносить какие-либо изменения в культуральную жидкость или питательную среду. Например, при производстве пенициллина можно внести фенилуксусную кислоту (как предшественник) для увеличения выхода целевого продукта. Также можно произвести корректировку по содержанию двуокиси углерода или по источнику азота, или изменить рН среды.

Следующий вид ферментации. Непрерывный процесс, при котором подача культуральной жидкости или питательной среды и отбор культуральной жидкости осуществляется небольшими порциями непрерывно. Такие процессы ферментации используют, например, для получения различных белков, однако, для производства антибиотиков – используются довольно редко. Рост продуцента при непрерывном культивированиипротекает постоянно в экспоненциальной фазе, т.е. длительное время не происходит смены фаз.

Лекция №6