Достижения генетической инженерии

С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика, позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией. Генная инженерия открыла путь для производства продуктов белковой природы путём введения в клетки микроорганизмов, искусственно синтезированных генов, где они могут встраиваться в состав гибридных молекул.

Первой удачной попыткой такого рода стала работа К. Итакуры и Г. Бойера с соавторами (1977г.) по экспрессии в химически синтезированного гена, кодирующего гормон млекопитающих — соматостатин. Ген соматостатина был получен на основе сведений о первичном строении этого пептидного гормона, состоящего всего из 14 аминокислот. Использованный в этой работе подход оказался весьма перспективным для получения и многих других пептидных гормонов. В различных лабораториях в СССР и за рубежом были созданы штаммы, синтезирующие в составе гибридных белков гормон роста человека (соматотропин), пептидные гормоны —брадикинин и ангиотензин, нейропептид лей- энкефалин и др.

Ген гормона роста человека длиной 584 п.н.— наиболее длинный из искусственно синтезированных в настоящее время. Он был встроен в плазмиду, реплицирующуюся под контролем промотора триптофанового оперона. Трансформированные полученной химерной плазмидой клетки продуцировали при индукции промотора около 3 млн. молекул гормона роста человека в расчёте на клетку. Этот полипептид, как было установлено в экспериментах на крысах с удалённым гипофизом, по функциям оказался полностью идентичен гормону роста человека.

В 1976г. Гилберт и Максам в Гарвардском университете, а также Сэнгер разработали быстрый метод химического анализа ДНК. Появилась реальная возможность определять последовательность до 1000 нуклеотидов в неделю силами одного исследователя. В 1982-1985гг. стало возможно создать прибор для автоматического анализа нуклеиновых кислот (а значит и генов).

Ещё один важнейший этап — это синтез биополимеров по установленной структуре. Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963г. Они используются в исследовательских лабораториях и в фармацевтической промышленности.

Метод химического синтеза генов обеспечил также возможность получения штаммов бактерий продуцентов инсулина человека, важного лечебного препарата для больных диабетом. «Ген инсулина синтезировали в виде более сорока в основном шестичленных олигонуклеотидов, которые затем объединяли в единую структуру с помощью ДНК- лигазы. Полученные двухцепочечные полинуклеотиды длиной 271 и 286 пар оснований были встроены в плазмидные векторы. Туда же были встроены и регуляторные участки ДНК, обеспечивающие экспрессию гибридных молекул. Клонированные гены кодировали синтез проинсулина, который путём несложной химической обработки можно превратить в активный инсулин, включающий две полипептидные цепи А и В из 21 и30 аминокислотных остатков, соединённых между собой сульфгидрильными связями». Таким способом получены и клонированы гены, кодирующие глобины человека,животных и птиц, белок хрусталика глаза быка, яичный белок, фиброин шелка, продуцируемый тутовым шелкопрядом, и др. Этот же принцип был применён для получения, клонирования и экспрессии генов интерферона человека в бактериях.

Интерферон- ценный лекарственный препарат, широко используемый для борьбы с вирусными инфекциями и лечения ряда других заболеваний, включая злокачественные опухоли.

Интерферон вырабатывается в клетках животных и человека, но обладает выраженной видовой специфичностью. Очищенный из клеток бактерий интерферон по своим физико-химическим и биологическим свойствам оказался близок интерферону, находящемуся в крови доноров. За счёт введения в векторную плазмиду сигнальных последовательностей, инициирующих синтез и РНК и белка, удалось получить бактерии, способные синтезировать до 5 мг интерферона в расчёте на 1л суспензии бактерий. Это в 5000 раз больше, чем содержится в 1лкрови доноров. Замена на микробы некоторых других видов позволяет ещё больше увеличить производительность такой «фабрики интерферона». К открытиям связанным с достижениями генной инженерии нужно прибавить то, что огромный генетический«чертёж» многоклеточного существа просчитан полностью.

После восьми лет работы многих исследовательских групп удалось точно определить 97 миллионов пар нуклеотидов и их местонахождение в спирали ДНК, хранящей полную наследственную информацию микроскопического червячка Сaenorhabditis elegans длиной около миллиметра. Хотя это очень маленький червь, скорее червячок, с него без всякого преувеличения начинается новая эра в биологии. Геном этой нематоды состоит из 97 миллионов пар нуклеотидов ДНК, округлённо 0,1 миллиарда пар. Геном человека, согласно большинству оценок, — 3миллиарда нуклеотидных пар. Разница в 30 раз. Однако именно эта работа, о которой идёт речь, окончательно убедила даже самых закоренелых скептиков, что расшифровка строения всего генома человека не только возможна, но и достижима в ближайшие годы. Естественно, расшифровать геном таких гигантских размеров, как у названной нематоды (97 миллионов пар нуклеотидов ДНК), невозможно без огромной подготовительной работы. Её в основном завершили к 1989 году. Прежде всего, была построена физическая карта всего генома нематоды. Физическая карта представляет собой небольшиеучастки ДНК известной структуры (маркеры), расположенные на определённых расстояниях один от другого. И вот с 1990 года началось само секвенирование. Его темп составлял в 1992 году 1 миллион пар нуклеотидов в год. Если бы такой темп сохранился, на расшифровку всего генома понадобилось бы почти 100 лет! Ускорить работы удалось простейшим способом — число исследователей в каждом центре возросло примерно до 100. По мере того, как раскрывалась нуклеотидная последовательность ДНК C. elegans, пришлось расстаться двумя заблуждениями: Во-первых, оказалось, что генов у неё не 15 тысяч, как предполагали вначале, а 19099. Во-вторых, надежда на то, что гены сосредоточены в середине хромосом, а к концам сильно редеют, оправдалась лишь отчасти: гены распределены вдоль хромосом относительно равномерно, хотя в центральной части их все-таки больше. В лабораториях мира полным ходом идёт расшифровка генома человека. Эта международная программа была начата в 1989 году.

Сейчас в разных странах мира, в лабораториях, разделивших между собой «фронт работ» (всего надо прочитать около трёх миллиардов пар нуклеотидов), ежедневно расшифровывается более миллиона нуклеотидных пар, причём темп работ все ускоряется. Если у дрожжей функция половины генов в геноме неизвестна (так называемые молчащие гены), то у червя C. elegans эта доля ещё больше: из 19 тысяч генов 12 тысяч остаются пока загадочными. Значение секвенирования генома нематоды, конечно, выходит далеко за рамки того, что можно назвать полигоном для расшифровки генома человека. C. elegans — первый многоклеточный организм, геном которого раскрыт практически полностью. Можно напомнить: несколько лет назад был расшифрован первый геном эукариотического организма — дрожжей, то есть организма, клетки которого содержат оформленные ядра. Иначе говоря, за два года был пройден путь от генома одноклеточного до генома многоклеточного организма. Программа «Геном человека»,как уже говорилось, — программа общечеловеческая. Каждая лаборатория, в какой бы стране она ни находилась, вносит в неё посильный вклад. И как только кому- то удаётся раскрыть структуру нового гена, эта информация немедленно поступает в Международный банк данных, доступный каждому исследователю. Сейчас, даже трудно предсказать все возможности, которые будут реализованы в ближайшие несколько десятков лет.