Хроматографические методы исследования

Хроматографией - процесс разделения, в котором используется различие между константами равновесия распределения компонентов разделяемой смеси между неподвижной фазой с большой удельной поверхностью и подвижной фазой, которая протекает через неподвижную фазу.

Хроматографическими называют процессы, основанные на перемещении вещества (газа или жидкость) вдоль пористого слоя или внутри ограниченного пространства в потоке, вызванном действием движущих и тормозящих сил, из которых по крайней мере одна зависит от молекулярной структуры или физико-химических свойств вещества.

Хроматографический процесс осуществляется при сорбционном распределении вещества между двумя фазами, одна из которых перемещается относительно другой. Поскольку скорость перемещения вещества (сорбата) и положение его зоны на слое сорбента в какой-либо момент времени определяются скоростью перемещения подвижной фазы и значением коэффициента распределения между неподвижной и подвижной фазами, смесь веществ, имеющих различные коэффициенты распределения, разделяется в процессе движения по слою сорбента.

Сорбция — поглощение газов, паров или растворенных веществ (сорбатов) твердыми или жидкими поглотителями (сорбентами). Обратный процесс называют десорбцией. В зависимости от природы сорбционных процессов их подразделяют на адсорбцию, абсорбцию и хемосорбцию.

Адсорбция — концентрирование вещества (адсорбата) на поверхности раздела фаз, вызванное физико-химическим взаимодействием адсорбата и поверхности. Адсорбирующее вещество называют адсорбентом. Если адсорбция сопровождается образованием на поверхности адсорбента химических соединений, то процесс называют хемосорбцией.

Абсорбиия — избирательное поглощение вещества (абсорбата) из раствора или газовой смеси жидкостью или твердым телом (абсорбентом) в объеме.

В газовой хроматографии элементарный акт сорбции обычно сводится к абсорбции компонентов газовой смеси жидкостью и (или) адсорбции на поверхности газ — твердое тело, газ — жидкость или жидкость — твердое тело.

Прибор для проведения газо-хроматографического процесса называется газовым хроматографом. Основными блоками являются:

-Блок подготовки газа-носителя, который подает стационарный поток выбранного газа носителя. В самых распространенных системах используется регулятор скорости потока. Массовая скорость газа-носителя через этот регулятор поддерживается постоянной. Другими словами, число молей газа, проходящего через колонку в единицу времени, является постоянным;

-Система ввода проб, которая обеспечивает ввод точного количества пробы в этот поток газа точно в начало колонки. Эта проба должна испаряться за достаточно короткое время и вводиться в колонку в виде цилиндрической пробки пара, разбавленного газом- носителем;

-Колонка, которая установлена в термостате с регулированием температуры. Выбираемая температура обычно заключается в диапазоне от комнатной температуры до 350 ºС, хотя были описаны анализы в более широком диапазоне (от — 130 С до +1000 С);

-Детектор, который обеспечивает сигнал, пропорциональный составу газа-носителя. Желательно, чтобы этот сигнал был нулевым, когда из колонки выходит чистый газ-носитель.

Для ввода в хроматографическую колонку газовой, жидкой или твердой пробы служит дозатор. Пробу можно вводить либо непосредственно в поток газа-носителя (например шприцем), либо в ограниченный объем, из которого она транспортируется газовым потоком в колонку. Разделение компонентов происходит в хроматографической колонке.

Насадочная хроматографическая колонка представляет собой металлическую или стекляную трубку, длиной L и сечением S, наполненную твердым адсорбентом, на который нанесена жидкая фаза.

После колонки устанавливается детектор, фиксирующий изменение состава, выходящей из колонки смеси (элюата).

Современный газовый хроматограф оснащается счетно-решающим устройством, которое, получив сигнал от детектора, осуществляет качественную и количественную расшифровку результатов анализа и выдает данные по содержанию индивидуальных компонентов.

Хроматографический метод используют для разделения и очистки смесей веществ.

Этот метод был впервые открыт М.С. Цветом (Варшава) в 1903 г. на примере разделения жидких растворов окрашенных органических компонентов при их прохождении через трубку (колонку), заполненную твердым адсорбентом. Вследствие разной адсорбции различно окрашенных компонентов раствора в трубке можно было обнаружить по-разному окрашенные зоны. Поэтому Цвет назвал этот новый вид анализа хромотографическим разделением, колонку с твердым адсорбентом - хроматографической колонкой, а само распределение в колонке по-разному окрашенных компонентов - хромотограммой. Очевидно, что физико-химические основы такого разделения остаются теми же и при прохождении через колонку с адсорбентом смесей неокрашенных веществ. В настоящее время хромотографическим разделяют не только растворенные вещества (неокрашенные и окрашенные), но и пары и газы. Поэтому термины хромотография, хромотографическая колонка и хромотограмма имеют более широкое значение.

Хроматографические методы классифицируют по принципу разделения в зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы (жидкостная и газовая) и по форме неподвижного слоя (бумажная, тонкослойная, колоночная).

Все более широкое применение в анализе различных малолетучих и термически нестабильных соединений (нуклеотидов, углеводов, пестицидов, кислот, наркотических и лекарственных препаратов и других соединений) находит метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Это - метод разделения веществ на мелкозернистых сорбентах с размером частиц менее 15 мкм при повышенном давлении. ВЭЖХ основывается на распределительном, адсорбционном, ионообменном, аффинном принципах разделения. Собственно хроматографические методы являются средством для разделения многокомпонентных смесей, но они не позволяют установить химическую природу веществ. Для этой цели используют детекторы — приборы для распознавания компонентов анализируемой смеси, выходящих из хроматографической колонки. Система детектирования состоит из 3 элементов — детектора, усилителя и регистратора. Детектор преобразует изменение состава элюента в электрический сигнал, который после усиления фиксируется регистратором.

Существующие способы детектирования и сами детекторы можно разделить на дифференциальные и интегральные. Дифференциальные детекторы передают мгновенное значение некоторой характеристики, а интегральные - суммируют количество вещества за определенный промежуток времени. Дифференциальные детекторы подразделяют на концентрационные и потоковые: первые регистрируют концентрацию вещества на выходе из хроматографической колонки, а вторые — произведение концентрации на скорость движения, то есть массовый поток вещества. Пре имуществом потоковых дифференциальных детекторов является независимость выхода сигнала от расхода элюента и слабая зависимость от температуры.

В хроматографии используют следующие детекторы: спектрофотометрические, поляриметрические, рефрактометрические, электрохимические, флуориметрические, масс-спектрометрические и ядерно-магнитного резонанса. Для анализа многих классов веществ наиболее всего подходит два типа детекторов: спектрофотометрические (регистрируют поглощение в УФ- и видимой области спектра) и рефрактометрические (измеряют разность показателей преломления стандартной и исследуемой проб).

Распределительная хроматография характеризуется тем, что фазы жидкие и представляют собой несмешивающиеся или частично смешивающиеся жидкости. В качестве неподвижной фазы служит вода хроматографической бумаги или сорбента, нанесенного на подложку в виде пластинки пленки и покрытого жидкой фазой (тонкослойная хроматография)или упакованного в колонку (колоночная хроматография). В качестве подвижной фазы при разделении, например аминокислот, применяют органические растворители, частично смешивающиеся с водой: фенол, креозолы, смесь бутилового спирта с уксусной кислотой и пр. Этот метод был разработан для разделения аминокислот, но в дальнейшем оказалось, что его можно применять для разделения и определения веществ различных классов.

Бумажная хроматография подразделяется на одномерную, двухмерную и круговую.

При тонкослойной хроматографии компоненты исследуемого раствора перемещаются в тонком слое сорбента, нанесенного на стеклянную пластинку и покрытого жидкой фазой. Для разделения нейтральных липидов и их гидролизатов рекомендуют различные растворители и смеси (петролейный эфир (или гексан) + бензол; гексан + тетралин; петролейный эфир + диэтиловый эфир и др.). В качестве сорбентов при тонкослойной хроматографии используют силикагель в смеси с гипсом и оксидом алюминия, оксид алюминия, кизельгур (для разделения триглицеридов, кетокислот, жирных кислот применяют кизельгур, который пропитывают высококипящими фракциями нефти).

В жидкостно-жидкостной хроматографии (ЖЖХ)неподвижную фазу помещают в колонку, затем вносят в нее анализируемую смесь и элюируют подходящим растворителем. При продвижении по колонке компоненты смеси удерживаются сорбентом в соответствии с их физико-химическими свойствами и, следовательно, мигрируют с разной скоростью. Из колонки разделяемые вещества смеси выходят в определенной последовательности и могут быть собраны в виде отдельных фракций.

При использовании колонки конечный результат зависит не только от того, насколько принцип разделения (распределение, адсорбция, ионообмен) соответствуют свойствам анализируемых веществ, но и от других факторов: свойств системы сорбент - элюент, условий элюирования (скорость потока, температура, вязкость элюента), конструкции и размеров колонки, нагрузки колонки (количество пробы), качества ее упаковки, размеров частиц сорбента и исследуемых веществ, качества подготовки пробы и др.

В ЖЖХнизкого давления компоненты смеси разделяют на хроматографической колонке при нормальном (гидростатическом) или несколько повышенном давлении.

Если в качестве неподвижной фазы используют мягкие сорбенты (сефадексы, биогель, агарозы, полистирольные гели), то хроматографию проводят при атмосферном давлении. Этот вид хроматографии применяют при переработке больших объемов жидкости при условии, что не ставится задача достижения высокого разрежения свойственного ВЭЖХ.

Гель-хроматография (молекулярно-ситовая хроматография) - метод, основанный на различной способности молекул разного размера проникать в поры нейтрального геля, который служит неподвижной фазой.

Газовая хромотография является одним из видов хромотографии, представляющей собой физико-химическое разделение компонентов подвижной фазы (газа, раствора) при ее движении вдоль другой неподвижной фазы (жидкости или твердого тела). Применяя длинные тонкие капилляры, в особенности капилляры с пористыми стенками, или заполняя более широкие трубки зернами пористого адсорбента, можно создать большую поверхность раздела газ - твердое тело, т.е. при медленном протекании газа осуществить многократно повторяющиеся процессы адсорбции и десорбции молекул компонентов газовой смеси. Это позволяет (даже при весьма малых различиях в средних продолжительностях жизни на поверхности твердого тела молекул разных компонентов газовой смеси) получить разные времена выхода компонентов из колонки или так называемые разные времена удерживания компонентов колонкой. Нанеся на стенки капилляра или в очень крупные поры зерен твердого носителя, заполняющего колонку, неподвижную жидкость, можно вместо различий в адсорбции использовать различия в растворимости различных компонентов газовой смеси. В первом случае имеет место газо-адсорбционная хромотография, во втором - газожидкостная или распределительная хромотография. Во втором случае, очевидно, имеют место процессы адсорбции компонента газовой смеси на поверхности неподвижной жидкости, растворения его в жидкости и адсорбции на поверхности твердого носителя этой неподвижной жидкости.

Хроматографическое разделение можно осуществлять разными способами. Первый способ заключается в том, что в колонку вводят газовую смесь с постоянной концентрацией компонентов. В этом случае у выхода из колонки появится сначала наименее адсорбирующийся или наименее растворимый компонент (например, воздух при аналогичной работе противогаза), затем смесь этого компонента с лучше адсорбирующимся компонентом, затем смесь этих двух компонентов с еще сильнее адсорбирующимися и т.д. вплоть до исходной смеси. Фиксируя появление и определяя концентрации выходящих компонентов, можно осуществить анализ смеси. Этот метод хроматографического разделения называется фронтальным анализом; существенный недостаток его состоит в том, что в чистом виде можно получить только один компонент.

Второй способ заключается в том, что через колонку пропускают непрерывный поток практически не адсорбирующегося (или не растворяющегося в неподвижной жидкости) газа и в тот газ-носитель у входа в колонку вводят небольшую порцию анализируемой смеси. В этом случае у выхода из колонки в токе газа-носителя сначала появится наименее адсорбирующийся (или наименее растворимый) компонент той смеси, далее чистый газ-носитель, затем сильнее адсорбирующийся компонент, снова газ-носитель и т.д. Таким образом, зоны выхода компонентов на хроматограмме оказываются отделенными газом-носителем. Этот метод хроматографического разделения называют пронзительным, промывным или элюционным анализом.

В проявительном анализе для промывания колонки после введения пробы применяется газ-носитель, который практически не адсорбируется или обычно адсорбируется слабее компонентов введенной пробы. Можно, наоборот, для промывания колонки после введения пробы применить поток вещества, которое адсорбируется сильнее всех компонентов пробы. Это вещество, очевидно, будет вытеснять из колонки компоненты введенной пробы. У выхода из колонки появится сначала наименее адсорбируемый компонент, затем его смесь со следующим по адсорбируемости компонентом, затем этот следующий компонент и т.п. вплоть до появления чистого вытеснителя. Это третий метод разделения называется вытеснительным анализом. Он уступает проявительному методу в том отношении, что при проявительном анализе выходящие из колонки компоненты пробы, как правило, разделены зонами чистого газа-носителя.

Большим преимуществом газовой хроматографии является быстрота разделения, которая определяется в основном лишь временем прохождения компонентов газовой смеси через колонку.

Кроме таких аналитических применений разделения компонентов смесей на основе различной их адсорбции или различной растворимости, газовая хроматография, очевидно, может быть применена и для решения обратной задачи, т.е. для быстрого определения адсорбции и теплоты адсорбции, величины поверхности твердого тела и ее химических свойств или для определения термодинамических свойств раствора в неподвижной жидкости и связанных с этими свойствами физико-химических величин (констант равновесия, изотерм распределения, коэффициентов активности, тепловых эффектов и т.п.).

Следует подчеркнуть, что поскольку основными физико-химическими процессами в газовой хроматографии являются процессы адсорбции и десорбции (или растворения или испарения), слишком сильно адсорбирующие адсорбенты (или слишком хорошо растворяющие жидкости) оказываются непригодными, поскольку они значительно задерживают процессы десорбции. Необходимо, чтобы процессы десорбции происходили достаточно быстро, иначе соответствующий компонент не успеет пройти колонку за удобное для анализа время. В этом отношении задача газово-хромотографической установки отличается от задачи противогаза (в противогазе необходимо как можно прочнее удержать компонент, отравляющий воздух, т.е. резко увеличить энергию его адсорбции, замедлить его десорбцию).

Уменьшить время десорбции в газо-адсорбционной хромотографии можно, применяя наиболее геометрически однородные поверхности, химически прививая к поверхности твердых тел слабее адсорбирующие однородные модифицирующие слои и проводя процесс при более высоких температурах.

Поверхность жидкости является идеально-однородной. Кроме того, химическую природу жидкости, применяемой в колонке в качестве неподвижной фазы, легко изменять в желаемом направлении в соответствии с природой разделяемых компонентов смеси, заменяя неполярные жидкости на жидкости, молекулы которых содержат благоприятствующие разделению функциональные группы. Поэтому получила большое распространение газожидкостная хромотография, разработанная Мартином.

Однако газожидкостная хромотография обладает и своими недостатками, связанными главным образом с летучестью разделяющих жидкостей при высоких температурах. Поэтому в настоящее время большое значение придает улучшению геометрической и химической однородности нелетучих твердых тел, что позволит применять газо-адсорбционную хроматографию для разделения более высококипящих веществ, слишком сильно адсорбирующихся на неоднородных поверхностях.

Адсорбционная хроматография - процесс разделения веществ, основанный на различной способности компонентов исследуемой смеси поглощаться поверхностью данного адсорбента. В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы метод носит название жидкостно-адсорбционной или газоадсорбционной хроматографии. Адсорбция - это результат проявления дисперсионных электростатических сил.

Адсорбенты бывают полярные и неполярные. В жидкостно- адсорбционной хроматографии (ЖАХ)разделение на полярном сорбенте называется хроматографией с нормальными фазами (НФХ),разделение на неполярном адсорбенте - хроматографией обращенными фазами (ОФХ).Вгазо-адсорбционной хроматографии (ГАХ)или с помощью полярного растворителя полярные вещества могут быть вытеснены с поверхности адсорбента (десорбированы) при повышении температуры.

В осадочной хроматографии основным фактором, определяющим разделение и выделение веществ из раствора смеси компонентов, является процесс образования осадков, различающихся растворимостью. Осадочную хроматографию проводят как на бумаге, так и в колонке. В верхней части колонки выделяются осадки веществ, менее растворимых, в нижней части - более растворимых. Смесь, заполняемая колонку, состоит из носителя - высокодисперсного вещества (сорбент) и осадителя - вещества, образующего с исследуемым ионом характерно окрашенное труднорастворимое соединение. При пропускании исследуемого раствора через хроматографическую колонку с сорбентом происходит обмен ионов, входящих в состав сорбента, на ионы хроматографируемого раствора.

Ионообменная хроматография основана на различной способности разделяемых ионов в растворе к ионному обмену с ионитом (неподвижная фаза), который представляет собой нерастворимую полимерную матрицу, несущую химически связанные ионогенные группы. Противоионы удерживаются на матрице за счет сил электростатического взаимодействия и могут обмениваться на ионы разделяемой смеси, присутствующие в подвижной фазе.

По химическому строению матрицы ионообменники подразделяются на следующие группы: синтетические смолы на основе полистирола или полиакриламида, сефадексы на основе сшитого декстрана, сефарозы - на основе агарозы, целлюлозные ионообменники на основе микрокристаллической или сшитой микросферической целлюлозы, неорганические иониты на основе поверхностно-модифицированных силикагелей. Тип ионообменника определяется природой функциональных ионогенных групп.

Ионообменную хроматографию проводят в водной среде.

В области анализа при помощи синтетических ионитов решают следующие задачи: определение общего содержания солей в растворе (путем ионообмена и последующего определения концентрации ионов водорода);

удаление посторонних ионов при неорганическом анализе;

анализ гидролизатов белков, олигонуклеотидов, полисахаридов;

определение хлорида натрия в соленых молочных продуктах, уровня загрязнения окружающей среды;

деионизация воды (деминерализованную воду часто ошибочно называют дистиллированной);

удаление ионогенных примесей, присутствующих в органических растворителях; очистка биополимеров, например отделение детергентов и амфолитов, присутствующих в растворах белковых препаратов;

замена противоионов в буферных растворах;

получение препаратов радиоактивных изотопов;

использование в качестве катализаторов многих технологических процессов - этерификации, омыления, дегидратации, гидратации, полимеризации, инверсии сахаров, перегруппировки, алкилирования, циангидринного синтеза, образования ацетатов, нитрования, эпоксидирования.

Аффинная хроматография - метод разделения биологически активных веществ, основанный на их специфическом взаимодействие с лигандами, ковалентно связанными с нерастворимым носителем (матрицей). В качестве лигандов используют соединения взаимодействие которых с разделяемыми соединениями основано на биологической функции последних.

Взаимодействие (вещество — лиганд) должно быть специфическим и обратимым. Обратимость процесса характеризуется константой диссоциации.

Лиганд должен иметь реакционноспособные функциональные группы, при помощи которых осуществляется его связь с матрицей, при этом должна сохраняться биоспецифическая активность лиганда. Если лиганд имеет несколько таких групп, его иммобилизация должна происходить с участием той из них, которая не входит в участок, взаимодействующий с целевым веществом. Активные центры многих биологически активных веществ (например, ферментов) часто локализованы в середине глобулы и недоступны для небольших молекул лигандов, непосредственно связанных с матрицей. Поэтому между матрицей и лигандом обычно встраивают дополнительный блок — «спейсер». В качестве матрицы служат гели агарозы или полиакриламида.

Аффинную хроматографию проводят в водных буферных створах, подбирая оптимальные условия для каждого конкретного случая. Можно создать такие условия (значение рН раствора и концентрация соли), при которых взаимодействие целевого вещества с лигандом будет наиболее сильным.

Среди других методов выделения веществ аффинная хроматография занимает особое место, поскольку процесс идет крайне специфически с использованием биологической активности целевого вещества. Эта особенность позволяет концентрировать целевые вещества из больших объемов раствора.

Из гелей на основе агарозы часто применяют сефарозу. Благодаря крупным порам внутренняя поверхность гранул доступна как молекул лигандов, так и для молекул целевых веществ. Матрица агарозы имеет незначительную неспецифическую сорбцию. Частицы сефарозы мало сжимаемы, вследствие чего обеспечиваются хорошие гидродинамические свойства колонки.

Аффи-гель — агарозный и полиакриламидный гель, модифицированный разнообразными функциональными группами. По сравнению с агарозными гелями материалы на основе полиакриламида имеют следующие преимущества: крайне незначительную неспецифическую сорбцию; биологическую инертность (устойчивы к действию ферментов); повышенную химическую и термо устойчивость.

Аффинную хроматографию применяют для выделения следующих классов веществ: аналогов субстратов ингибиторов, кофакторов (при этом роль лигандов играют ферменты); антигенов вирусов клеток (лиганды — антитела); полисахаридов, гликопротеинов клеток (лиганды — лектины); гистонов, полимераз (лиганды - нуклеиновые кислоты); рецепторов, белков-переносчиков (гормоны, витамины); белков, специфически взаимодействующих с мембраной клетки, лектинов (лиганды - клетки).