Этапы приготовления препарата

РУКОВОДСТВО ДЛЯ СТУДЕНТОВ

К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

ПО МИКРОБИОЛОГИИ

«Энгельсский медицинский колледж»

А.В. Палиенко

РУКОВОДСТВО К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ

по курсу «Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований»

раздел «Морфология микроорганизмов»

Руководство для студентов

отделения 060110 «Лабораторная диагностика»

г. Энгельс, 2009 г.

РЕЦЕНЗИЯ

на руководство к практическим занятиям

по курсу «Микробиология с основами эпидемиологии и методами микробиологических исследований»

раздел «Морфология микроорганизмов»,

составленное преподавателем микробиологии А.В. Палиенко

Представленная работа составлена в соответствии Государственного стандарта и квалификационной характеристики специальности 060110 «Лабораторная диагностика». Построено в соответствии современными педагогическими и методическими требованиями. Данное руководство обеспечит самостоятельность студентов в работе на практических занятиях по микробиологии и облегчит педагогический процесс. Для эффективного усвоения материала имеются вопросы и тестовые задания для студенческого самоконтроля. По каждому занятию указан объем выполняемой практической работы. Приведенные в работе алгоритмы, рисунки, схемы помогут систематизировать и закрепить знания студентов по данной теме.

В руководстве приводится микроскопический метод исследования микроорганизмов, который позволяет изучить тинкториальные и морфологические свойства микроба, степень чистоты выделенной культуры, расположение микроорганизмов в мазках, выявить структуры клетки – споры, капсулы, определить подвижность микроба, дифференцировать кислотоустойчивые бактерии. Все эти признаки необходимы для идентификации микроорганизма. С помощью этого метода можно подтвердить клинический диагноз инфекционных заболеваний.

Учебное пособие предназначено для использования во время практических занятий по микробиологии раздел «Морфология микроорганизмов», а также для самостоятельной работы студентов дома.

Рецензент: Глинская Е.В., к.б.н., доцент кафедры микробиологии и физиологии растений биологического факультета СГУ им. Н.Г.Чернышевского

СОДЕРЖАНИЕ

Предисловие…………………………………………………...……...5

Введение в практикум………………………………………………..6

Занятие №1……………………………………………………………8

Занятие №2……………………………………………………………16

Занятие №3……………………………………………………………19

Занятие №4……………………………………………………………22

Занятие №5…………………………………………………………....24

Занятие №6…………………………………………………………....26

Ответы на тестовые задания ………………………………………...31

Список литературы…………………………………………………..32

Приложение №1……………………………………………………....33

Приложение №2……………………………………………………....35

ПРЕДИСЛОВИЕ

Лабораторные занятия проводятся в специально оборудованных помещениях, имеющих подводку электричества к каждому рабочему месту, а также раковину с водопроводной водой. Поверхность рабочих столов покрыта стеклом для лучшей дезинфекции. За каждым студентом закрепляется постоянное рабочее место, на котором должно быть оборудование, необходимое для выполнения конкретного задания, рабочая тетрадь, ручка и карандаш. Для личных вещей отводится специальное место.

В начале занятия студенты знакомятся с определенным заданием, изложенным в учебном пособии, делают записи основных методик в рабочей тетради, а затем приступают к выполнению работы под наблюдением преподавателя. Результаты исследований в виде рисунков, описаний морфологии микроорганизмов заносятся в тетрадь, и работа представляется преподавателю для проверки.

В связи с тем, что на практических занятиях студенты работают с живыми культурами микробов, анилиновыми красителями, химическими веществами, а также используют электрические приборы (лампы) и спиртовки, они обязаны выполнять основные правила техники безопасности (приложение №1,2).

Все задания студентами выполняются самостоятельно в соответствии с задачами, поставленными в учебном пособии.

Автор будет признателен за все замечания и предложения по содержанию включенного материала и совершенствованию методики обучения.

ВВЕДЕНИЕ В ПРАКТИКУМ

Микроскоп (рис.1) - оптический прибор для изучения микрообъектов. Студенческие лаборатории чаще оснащены микроскопами МБИ-1 . В научных и практических микробиологических лабораториях используют микроскопы отечественных марок: МБР – 1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, Биолам Р-1 и другие. Они предназначены для изучения формы, структуры, размеров и других признаков микроорганизмов, величина которых не менее 0.2-0.3 мкм. Поскольку микро­бы очень малы, то измеряются они в микрометрах (мкм - тысячная доля миллиметра) и потому изучение их возможно только с помощью микроскопов, дающих достаточно большое увеличение. Общее увеличение микроскопа слагается из произведения увеличений объектива и окуляра. Обычно при микробиологических исследованиях для получения полезного увеличения в 600-1000 раз используют объективы с увеличением в 90-100 раз и окуляры, увеличивающие изображение в 7-10 раз.

Объективы подразделяются на сухие и иммерсионные (погруженные). При работе с сухими объ­ективами между фронтальной линзой и изучаемым объектом находится воздух. При этом, в виду раз­ницы коэффициентов преломления предметного сте­кла и воздуха, часть световых лучей отклоняется и не попадает в объектив.

Объективы иммерсионные обозначают буквами О.И. и цифрами х90 и х100.

Современные микроскопы имеют ряд усовершенствований. Так, бинокулярный микроскоп с двумя тубусами дает возможность вести наблюдение однов­ременно обоими глазами.

Для изучения неокрашенных объектов используется фазово-контрастное устройство, с помощью которого можно получить четкое контрастное изображение прозрачных, не имеющих окраски микроорганизмов. При прохождении света через окрашенный препарат, изменяется интенси­вность света (амплитуда световой волны), что лег­ко улавливается глазом. При прохождении же пучка света через неокрашенный, прозрачный объект изме­няется только скорость его движения, т.е. фаза ко­лебаний светового луча, что глазом не улавливается. Принцип фазово-контрастного устройства заклю­чается в переводе невидимых колебаний света в амплитудные видимые.

В ряде специальных исследований, в частности при изучении внутри­клеточных структур микроорганизмов, используется люминесцентная микроскопия, основанная на способности некоторых объектов при специальном окрашивании флюорохромами светиться в коротковолновых лучах света (ультрафиолетовых, синих и др.). К флюорохромам относятся акридиновый желтый, пиронин, акридиновый оранжевый. Люминесцентная микроскопия проводится с обычным микроскопом, сна­бженным источником ультрафиолетовых лучей и набором светофильтров, вы­деляющих коротковолновую часть спектра.

Наиболее совершенными приборами, дающими возможность получать полезное увеличение объекта в 200-500 тыс. и более раз, являются электронные микроскопы, в которых вместо световых лучей используется поток электронов. С помощью электронных микроскопов удается рассмотреть белковые молекулы.

Рис. Микроскоп:

1 – окуляр, 2 – тубус,

3 – тубусодержатель,

4 – револьвер объективов,

5 – предметный столик,

6 – конденсор,

7 – микровинт, 8 – макровинт

9 – зеркало, 10 - основание

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №1

Простые и сложные методы окрашивания. Окраска препаратов по методу Грама. Способы приготовления красителей.

Студент должен знать:

- технику безопасности в кабинете (лаборатории) микробиологии (приложение №1),

- требования к помещению и оборудованию в лаборатории (приложение №2),

- характеристика «грязной» и «чистой» зоны лаборатории. Перечень комнат и их предназначение,

- требования к проведению работ в бактериологической лаборатории,

- спецпрофилактика сотрудникам лаборатории,

- этапы приготовления препарата, его фиксация: виды и цель,

- простые методы окрашивания,

- сложные методы, сущность метода Грама,

- особенности окраски по методу Грама, красители и реактивы,

- подготовка насыщенных, водных растворов и красителей.

Студент должен уметь:

- доставка патологического материала. Материал на патогенные биологические агенты (ПБА),

- прием материала в регистратуре,

- обработка отработанного материала и лабораторной посуды,

- поведение при «аварии» в лаборатории,

- приготовление бактериального препарата,

- окраска препарата по методу Грама,

-микроскопия окрашенных препаратов с использованием иммерсионной системы,

- соблюдение мер безопасной работы с живыми культурами микробов,

- обработка рабочего места и рук дез. веществами.

Этапы самостоятельной аудиторной работы:

1. Подготовить препараты и окрасить их простым методом и по методу Грама

2. Препараты промикроскопировать с иммерсией

3. Обработать рабочие места и руки

4. Зарисовать результаты микроскопирования в дневник

Рецепты приготовления красителей

1. Карболовый фуксин Циля:

- насыщенного спиртового раствора основного фуксина – 10 мл

- раствора карболовой кислоты 5% - 90мл

Внимание! Карболовую кислоту вливают в краситель, а не наоборот. Смесь встряхивают, фильтруют и сливают во флакон

Или

- основной фуксин в порошке - 1 гр

- карболовая кислота кристаллическая -5 гр

- глицерин -0,5 мл

- спирт 96% - 10 мл

- вода дистиллированная - 100мл

2. Насыщенные спиртовые растворы (исходные):

- красителя - 1гр

- спирта 96% - 10 мл

Смесь помещают в термостат на несколько дней до полного растворения. Взбалтывают ежедневно, хранят с притертыми пробками

3. Фуксин Пфейффера:

- фуксин Циля – 1 мл

- воды дистиллированной – 9 мл

Готовят непосредственно перед употреблением, т.к. раствор нестойкий.

4. Бумага по Синеву:

- 1%спиртовой раствор кристаллического фиолетового:

на 100 мл 96% спирта добавляют 1 гр сухого красителя и 3 мл глицерина

Полоски фильтровальной бумаги пропитывают раствором и высушивают.

ЭТАПЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТА

1. Приготовление мазка

2. Высушивание

3. Фиксация

4. Окрашивание