Розділ 4: фізіологія крові

Лабораторно-практичне заняття № 20. ____________________

Тема: Вивчення складу крові та його значення.

Завдання:запишіть склад крові у %.

________________________________

Дослід № 1. Взяття крові та синовіальної рідиниу тварин

Кров беруть у тварин з додержанням правил асептики і антисепти­ки. На шкірі в місці пункції вистригають або вибривають шерсть. При необхідності шкіру миють теплою водою з милом та просушують мар­левою серветкою, дезінфікують 70%-вим розчином етилового спирту або 5%-вим спиртовим розчином йоду.

Мета роботи.Засвоїти техніку взяття проб крові у різних видів тварин.

Прилади і матеріали. Тварини різних видів (велика рогата худоба, ко­ні, вівці, кози), стерильні ножиці Купера, голки для взяття крові, штатив з пробірками, гумовий джгут, етиловий спирт, 5%-вий роз­чин йоду, ефір, марля чи вата, спиртовий розчин ефіру, 3,8%-вий розчин цитрату натрію.

Хід роботи.У коней, великої рогатої худоби та овець велику кількість крові бе­руть з яремної вени на межі верхньої та середньої третини шиї. Твари­ну фіксують і нижче місця взяття крові накладають гумовий чи звичай­ний джгут або вену здавлюють пальцями. Це сприяє наповненню вени кров'ю і вона краще простежується. Після підготовки шкіри кровопус­кальною голкою проколюють її, а потім — судину під кутом 45° проти руху крові.

Витікаючу з голки кров на­правляють по стінці в пробірку чи циліндр. Після взяття необхідної кількості крові знімають джгут або перестають здавлювати вену пальцями. На шкіру в місці вве­дення голки накладають вату, змочену спиртом, притискують її до тіла тварини і виймають голку. Останнім часом для взяття крові у великої рогатої худоби викорис­товують прилади-автомати різної конструкції. В кожнім з таких авто­матів є металевий корпус, тримач для пробірки, ударний механізм з пружиною та голкотримач.

Невелику кількість крові у коня, великої рогатої худоби, свині, вівці, кози, кроля чи дрібніших тварин можна взяти шляхом проколу стериль­ною голкою крайової чи вушної вени або надрізавши скальпелем кінчик вуха. Першу краплю крові знімають стерильною ватою, а наступні її краплі беруть для дослідження.

У свиней велику кількість крові одержують з краніальної порожнистої вени або при надрізі кінчика хвоста стерильним скальпелем чи ножиця­ми. Після взяття необхідної кількості крові місце надрізу хвоста дезінфікують, а його кінчик вище нанесеної рани здавлюють протягом декількох хвилин бинтом або одягають на нього гумове кільце.

У собак велику кількість крові беруть із вени сафени, для чого тва­рину кладуть на бік і фіксують. У ділянці верхньої третини стегна накла­дають джгут. Після наповнення вени голкою проколюють шкіру та стінку судини. Кров беруть у шприц. Після взяття необхідної кількості крові джгут знімають, шкіру в місці введення голки притискають до тіла ватою і витягують голку з тканини. Рану протирають спиртом чи 5%-вим розчином йоду.

У кролів найчастіше всього кров беруть безпосередньо з серця. Для цього тварину фіксують на правому боці, готують місце пункції та вво­дять голку в третій міжреберний проміжок зліва на 3-4 см вище зовнішнього краю грудної кістки.

У морських свинок кров беруть з серця, для чого роблять пункцію в точці найбільш сильного поштовху. Кінчик голки ставлять біля лівого краю грудної кістки. Швидким рухом проколюють шкіру і всі тканини в напрямку до середньої площини в ділянці грудної порожнини на глибину 1,5-2 см. Голка, яка правильно введена в серце, буде рухатися в такт скороченню його м'яза. Голку з'єднують зі шприцом і в нього беруть кров. Щоб попередити її зсідання, спочатку голку та шприц змочують 2-3 краплями розчину гепарину. Невелику кількість крові у морських сви­нок одержують шляхом надрізу краю вуха або проколу його голкою, по­передньо змазавши шкіру вушної раковини ксилолом.

У мишей та щурів кров беруть з судини хвоста шляхом надрізу його кінчика ножицями.

У птахів кров одержують з підкрильцевої вени. Вона проходить під шкірою з внутрішньої сторони крила. Попередньо в цьому місці вищипу­ють пір'я, шкіру дезінфікують та протирають розчином гепарину, через те, що кров у птиці швидко загусає. В пробірку або на годинникове скло, в яке збирають кров, також наносять 2-3 краплі 1%-вого розчину гепа­рину. Невелику кількість крові у птахів найчастіше беруть шляхом надрізу або проколу голкою гребеня або сережок, а у гусей та качок — проколу м'яких тканин у ділянці міжпальцевих перетинок.

У риб невелику кількість крові одержують із підшкірної або глибокої хвостової артерії. Кров у риб можна також брати із серця, при цьому ін'єкційну голку вводять за сагітальною лінією між грудними плавника­ми з одночасним легким нахилом у бік голови.

У жаби невелику кількість крові можна одержати при ампутації пальців лапки або пункцією шкірної вени, яка розміщена посередині черева. Кров також одержують пункцією з оголеного серця.

Для отримання синовіальної рідини коня фіксують у станку. Готують поле операції в ділянці гомілково-надп'ясткового суглоба. Синовіальну рідину отримують шляхом пункції гомілково-надп'ясткового суглоба через передньо-внутрішній або задньо-зовнішній (при загнутій кінцівці) вивороти суглобової капсули і стабілізують 3,8%-вим розчи­ном цитрату натрію у співвідношенні 1:9.

Висновок: ________________

__________________________________

Дослід № 2. Одержання плазми та сироватки крові.

Мета роботи. Засвоїти методику одержання плазми та сироватки крові.

Прилади і матеріали. Тварини, ножиці, стерильні голки для взяття крові, етиловий спирт, ефір, 5%-вий розчин йоду, пробірки, 1% -вий розчин гепарину, 5%-вий розчин цитрату натрію, вата, джгут.

Хід роботи. Для отримання плазми в градуйовану пробірку наливають 0,5 мл 5%-вого розчину цитрату натрію, або 2-3 краплі 1 %-вого розчину гепарину. В неї беруть у тварини 4,5 мл крові. Вміст пробірки добре перемішують і центрифугують протягом 20 хв при 3000 об/хв. Формені елементи ося­дуть на дно, а плазма буде над ними (рис. 36). Вона має світло-жовтий колір. Кров з антикоагулянтом можна і не центрифугувати, а залишити в пробірці на декілька годин при кімнатній температурі. Вона також розша­рується на дві частини — плазму та формені елементи.

Для одержання сироватки кров беруть у пробірку без антикоагулянту і ставлять в термостат при температурі 37-38° С на 40-60 хвилин. Кров зсідається з утворенням згустка темно-вишневого кольору. Згусток крові, який утворився, відділяють стерильною дротинкою або піпеткою від стінки пробірки. На початку згусток пухкий і займає майже весь простір пробірки. Далі він ущільнюється і зменшується в об'ємі, настає ретракція. Навколо нього рідина жовтого кольору — сироватка.

Рис. 36. Отримання плазми та сироватки крові.

Висновок: ________________

__________________________________

Дослід № 3. Ретракція кров'яного згустку.

Ретракція — процес скорочення, ущільнення згустку крові з наступ­ним виділенням з нього сироватки. Тривалість ретракції згустку зале­жить від вмісту в крові тромбоцитів, фібриногену, іонів кальцію, темпе­ратури оточуючого середовища та інших факторів (рис. 37).

Мета роботи.Ознайомлення з методикою визначення ретракції згу­стку крові та з'ясування цього процесу в організмі тварин.

Прилади і матеріали.Тварина, стерильні голки для взяття крові, но­жиці, термостат, штатив, центрифужні пробірки з поділками, скля­на паличка, спирт етиловий, ефір, вата, марлеві серветки.

Хід роботи. В чисту центрифужну пробірку з поділками беруть з яремної вени тварини 5 мл крові. В кров паралельно до стінки пробірки ставлять скляну паличку з негладкою поверхнею або металевий стрижень і закріпляють його пробкою. Пробірку ставлять у термостат при темпе­ратурі 57° С на 12-15 годин або залишають при кімнатній температурі (20' С) на добу. За цей час кров у пробірці зсядеться і зі згустку виділиться сироватка. Скляну паличку виймають з пробірки, а разом з нею і згусток. За шкалою пробірки визначають об'єм (в мл) виділеної сироватки і вираховують його відношення до об'єму (в мл) взятої для дослідження крові за формулою:

Х=А/Б,

де X - коефіцієнт ретракції згустка;

А - кількість виділеної сироватки крові;

Рис. 37. Ретракція кров'яного згустку.

Висновок: ________________

__________________________________

Дослід № 4. Одержання фібрину та дефібринованої крові.

Мета роботи. Освоїти методику одержання фібрину та дефібрино\ваної крові.

Прилади і матеріали. Тварини, ножиці, стерильні голки кровопус­кальні, склянка, дерев'яна чи пластмасова паличка, етиловий спирт, ефір, 5%-вий розчин йоду, вата, джгут.

Хід роботи.Кров беруть у тварин в склянку і розмішують декілька хвилин спеці­альною паличкою, на яку осідають нитки фібрину (рис. 38). Паличку вий­мають з склянки, фібрин знімають з палички, промивають водою до бі­лого кольору. Кров, яка залишилась у склянці, є дефібринованою. Вона в подальшому не зсідається. З неї можна одержати сироватку шляхом відстоювання або центрифугування.

Рис. 38. Одержання фібрину.

Висновок: ________________

__________________________________

Лабораторно-практичне заняття № 21. ____________________

Тема: Дослідження фізико-хімічних властивостей крові.

Дослід № 1. Визначення гематокритного числа.

У сільськогосподарських тварин відносні об'єми плазми і формених елементів залежать від стану здоров'я. Тому їх визначення має клінічне значення.

Мета роботи. Засвоїти метод визначення об'єму формених елементів і плазми крові.

Прилади і матеріали.Кров різних тварин, гематокрит, центрифуга, скляні гематокритні трубочки, гепарин, оксалат алюмінію, оксалат натрію, годинникове скло, вата, марля.

Хід роботи.Відносні об'єми формених елементів і плазми крові визначають з допомогою гематокрита (рис. 39). До його складу входять дві скляні трубочки, відкалібровані на 100 рівних поділок. Для цього також можна використати піпетки Панченкова, у яких треба відрізати верхню части­ну, а нижню, довжиною 10-11 см, використати як гематокритну трубоч­ку. Для попередження зсідання крові використовують різні методи. На шкіру тварини в місце уколу голки кладуть невелику кількість криста­ликів оксалату натрію або трубочки попередньо обробляють протизсідальною речовиною. Кращий результат отримують, якщо трубоч­ку перед використанням промити гепарином (3 мг/мл) і висушити при кімнатній температурі. В кожну трубочку набирають кров, старанно пе­ремішують її з антикоагулянтом, видуваючи на годинникове скло і зно­ву відсмоктуючи. Отвори наповненої кров'ю трубочки закривають гу­мовим кільцем. Трубочку поміщають в гнізда гематокриту, центрифу­гують 30 хв. при 5000 об/хв. Кров чітко розділяється на два шари — ери­троцитів та плазми. За кількістю кожного з них визначають вміст у крові формених елементів і плазми. У жуйних і коней вміст формених еле­ментів в середньому складає 0,35-0,45 л/л, а плазми — 0,55-0,65 л/л (літрів на літр).

Рис. 39. Гематокрит.

Висновок: ___________________________________________________

Дослід № 2. Визначення в’язкості крові.

Мета роботи. Ознайомлення з методом визначення в'язкості крові, плазми і сироватки.

Прилади s матеріали.Тварина, віскозиметр, кров, сироватка.

Хід роботи.В'язкість визначають за швидкістю витікання крові із капіляра віско­зиметра в порівнянні зі швидкістю витікання води при тих же температурі і атмосферному тиску. Віскозиметр (рис. 40) тримають у вертикальному положенні. В один його капіляр набирають воду, в другий — сироватку чи кров до відмітки "0". Потім відкривають крани і відмічають час витікан­ня води і сироватки чи крові. Швидкість витікання обернено пропорційна в'язкості. Час витікання сироватки чи крові треба розділити на час витікання води. Одержаний результат і буде складати рівень в'язкості сироватки чи крові в порівнянні з водою.

За відсутності віскозиметра мож­на використати мікропіпетки місткістю 0,1-0,2 мл.

Рис. 40. Віскозиметр.

Висновок: ________________

__________________________________

Дослід № 3. Визначення щільності крові

Мета роботи.Засвоїти методи визначення щільності крові.

Прилади і матеріали.Хлороформ, бензол, циліндр, кров, піпетка.

Хід роботи. Для цього досліду готують суміш з щільністю в межах 1,05-1,055, в яку входять дві частини хлороформу та 5,5 частини бензолу. В скляний циліндр місткістю 100 мл наливають 70-80 мл цієї суміші. З допомогою піпетки в неї обе­режно випускають краплю крові (рис. 41). Якщо крап­ля осідає на дно, то до суміші добавляють ще хлороформу, а якщо плаває на поверхні, — бензолу. Це роблять до тих пір, поки крапля не зупиниться в суміші на середньому рівні. Тоді щільність крові і суміші буде однаковою. За допомогою ареометра визначають щіль­ність суміші, а значить — і крові.

За відсутності ареометра щільність або питому вагу крові визначають так. У мірний циліндр беруть 20 мл бензолу (питома вага 0,88) і 10 мл хлороформу (питома вага 1,485). В суміш вносять 1-2 краплі крові. Якщо крапля опускається на дно, то в суміш додають хлороформ, якщо спливає, — бензол. їх дода­ють до тих пір поки крапля крові не займе середнє положення, тобто питома вага крові буде такою ж, як і суміші. Після цього вираховують питому вагу крові. Наприклад, в циліндр взято 20 мл бензолу і 10 мл хлороформу, додали 1 мл бензолу і 2 мл хлороформу, одержали суміш з 21 мл бензолу і 12 мл хлороформу з загальним об'ємом 33 мл.

Питома вага суміші: (21 x 0,88 – 12 x 1,485) / 33 = 1,100

Рис. 41. Визначення щільності крові.

Висновок: ________________

__________________________________

Лабораторно-практичне заняття № 22. ____________________

Тема: Визначення буферних властивостей крові.

Дослід № 1. Визначення буферних властивостей крові.

У крові здорових тварин спостерігається постійний рівень концент­рації водневих іонів (рН), не дивлячись на значні її зміни в тканинах. Во­на регулюється декількома механізмами і підтримується буферними системами.

Мета роботи. Ознайомлення з методикою визначення буферних вла­стивостей крові.

Прилади і матеріали. Сироватка крові різних видів тварин, бюретки, склянки, очні та мірні піпетки, іономір, 0,1 N розчин соляної кисло­ти, 0,1 N розчин їдкого натрію, індикатори: 0,1%-вий розчин мети­лоранжу, 0,1%-вий розчин фенолфталеїну, дистильована вода, ва­та, марля.

Хід роботи.Виявлення лужного буфера проводиться в двох паралельних про­бах. В першу склянку (контрольна проба) беруть 10 мл дистильованої води, а в другу — 10 мл дистильованої води з 1 мл сироватки крові. В кожну пробу вносять по 2 краплі 0,1%-вого розчину метилоранжу. їх титрують, починаючи з контрольної проби, 0,1 N розчином соляної кис­лоти до виникнення слабкомалинового кольору, тобто до кислої реакції. Враховують витрату розчину кислоти в краплинах і визначають, на скільки більше необхідно добавити соляної кислоти до сироватки порівняно з водою, щоб реакція її стала кислою.

Виявлення кислотного буфера проводиться також при наявності кон­тролю. Для цього в першу склянку наливають 10 мл дистильованої води (контроль), а в другу — 10 мл дистильованої води та 1 мл сироватки крові. В кожну склянку добавляють по 2 краплі 0,1%-вого розчину фенолфта­леїну. Рідину перемішують і титрують, починаючи з контролю, 0,1 N роз­чином їдкого натрію до виникнення рожево-червоного забарвлення. Визначають, скільки крапель розчину їдкого натрію пішло на титрування лише води та суміші води з сироваткою крові. Потім вираховують, у скільки разів більше необхідно додати їдкого натрію, щоб у другому ви­падку, порівняно з першим, реакція була лужною.

Кислотний та лужний резерв крові (буферність) визначають шляхом титрування. В дві градуйовані бюретки наливають: в одну 0,1 N розчин соляної кислоти, в другу — 0,1 N розчин лугу. В дві скляночки беруть по 5 мл дистильованої води, в одну додають дві краплі розчину фенолфта­леїну і титрують розчином лугу до появи рожевого (малинового) кольо­ру. В другу склянку додають 2 краплі розчину метилоранжу і титрують розчином кислоти до появи оранжево-червоного кольору. Враховують кількість розчинів кислоти і лугу, витрачені на титрування. Кислотний і лужний резерв визначають шляхом розрахунку. Наприклад, на 5 мл во­ди пішло 0,2 мл 0,1 N розчину кислоти (або лугу), а на 100 мл буде вико­ристано X. Кислотний або лужний резерв дорівнює:

(100 х 0,2) :5 = 4.

Висновок: ________________

__________________________________

Дослід № 2. Визначення вмісту гемоглобіну в крові.

Гемоглобін — основна складова частина еритроцитів — хромопро­теїд, в гемі якого міститься двохвалентне залізо, його кількість в крові залежить від віку, виду, породи, фізіологічного стану тварин і інших фак­торів. Визначенню гемоглобіну в крові надається велике значення в клінічній практиці, для цього використовують різні методи.

В нормі вміст гемоглобіну складає (г/л): у великої рогатої худоби — 84,4-117,8; у свиней — 92-114; у коней — 90-149; у овець — 82-113.

Мета роботи. Визначити вміст гемоглобіну в крові різних тварин.

Прилади і матеріали. Кров тварин, штатив з пробірками, гемометр Салі, 0,1 N розчин соляної кислоти, дистильована вода, мірні піпет­ки, капіляр для гемометра місткістю 0,02 мл, вата, марля.

Хід роботи. Колориметричне визначення гемоглобіну проводиться гемомет­ром, в комплект якого входять мікропіпетки і скляна паличка (рис. 42).

Прилад складається із пластикового корпусу з трьома гніздами для пробірок. В задній стінці корпусу вмонтовано матове, білого кольору скло, яке розсіює світло. В бокові гнізда встановлені однакового розміру запаяні пробірки з стандартним розчином солянокислого ге­матину, а в середнє гніздо — градуйована пробірка для крові, яку досліджують. На всіх пробірках є дві кругові контрольні мітки. Нижча з них відповідає ємності 0,2 мл, а верхня — 2 мл.

Рис. 42.Гемометр:

1 - корпус приладу; 2 - пробірки з стандартними розчинами; З - градуйовані пробірки; 4 - піпетки для одержання крові.

Для визначення гемоглобіну в градуйовану пробірку гемометра на­ливають 0,1 N розчин соляної кислоти до нижньої поділки. В капілярну піпетку, додану до приладу, беруть 0,02 мл крові. Кінець піпетки витира­ють ватою, опускають її на дно пробірки в розчин соляної кислоти і виду­вають кров. Піпетку, не витягуючи з пробірки, декілька разів промивають розчином з верхнього шару. Після цього вміст пробірки старанно пе­ремішують і залишають на 5 хв у штативі для повного гемолізу еритро­цитів. Гемоглобін, вступаючи в реакцію з соляною кислотою, утворює солянокислий гематин, який має коричневе забарвлення. Через 5 хв у пробірку краплями, постійно перемішуючи скляною паличкою, додають дистильовану воду до тих пір, поки колір рідини не зрівняється з кольо­ром стандартного розчину. За малою шкалою пробірки (від 0 до 23) виз­начають вміст гемоглобіну в г%, а за великою (від 0 до 140) — у віднос­них одиницях гемометра (од. Салі). Якщо на пробірці нема великої шка­ли, то відносний вміст гемоглобіну вираховують шляхом множення на 6 кількості гемоглобіну, приведеної в г%, оскільки 1 г% його відповідає 6 одиницям.

Гемоглобін визначають також за допомогоюі автоматичного прила­ду "Культер", який показує його кількість в грамах на 100 мл на спеціальнім табло або записує на бланку.

Висновок: ________________

__________________________________

Лабораторно-практичне заняття № 23. ____________________

Тема: Підрахунок кількості еритроцитів.

Дослід № 1. Підрахунок кількості еритроцитів під світловим мікроскопом.

Еритроцити складають основну масу клітин крові, їх кількість у крові кожного виду тварин є відносно постійною. Вона може змінюватися в залежності від віку, статі, продуктивності, фізіологічного стану тварини і інших умов.

Мета роботи. Засвоїти методику підрахунку кількості еритроцитів у крові різних видів тварин.

Прилади і матеріали. Різні види тварин або проби крові від них, гол­ки для взяття крові, ножиці, мікроскоп, змішувач для еритроцитів, пробірки, камера Горяєва, покривне скло, 1%-вий розчин хлорис­того натрію, вата, марля, 75%-вий розчин йоду, 2-5 мікропіпетки місткістю 0,02 мл (рис. 43).

Хід роботи.Спочатку готують обладнання. Камеру Горяєва та покривні скельця промивають водою, висушують на повітрі чи з допомогою марлі і зне­жирюють етиловим спиртом, а потім ефіром. Такі ж маніпуляції викону­ють із мікропіпетками, але воду та знежирюючі речовини послідовно 2-3 рази набирають в них і випускають. Для зручності в роботі до мікропіпеток приладнують гумову грушу або ж гумовий шланг довжи­ною 60-70 см. Через нього всмоктується в піпетку необхідна кількість крові.

Далі готують 1%-вий розчин хлористого натрію, його розливають по 4 мл в пробірки, які ставлять у штатив. Пробірок з розчином має бу­ти стільки, скільки планується взяти для дослідження проб крові.

а б в

Рис. 43.а – сітка камери Горяєва; б – кмера Горяєва; в – еритроцитарний змішувач Горяєва.

Кров у тварини беруть з вуха, дотримуючись правил асептики. Пер­шу її краплю знімають ватою з шкіри. З другої краплі крові набирають в мікропіпетку 0,02 мл і випускають в пробірку з 4 мл 1%-вого розчину хлористого натрію. Мікропіпетку промивають ще 2-3 рази в розчині цієї ж пробірки та в аналогічному розчині, який налитий в окрему склянку чи пробірку. В останньому випадку розчин хлористого натрію набирають в мікропіпетку, а потім видаляють з неї в зливний стакан. Після цього мікропіпетку можна застосовувати для взяття проби крові у наступної тварини. Пробу крові старанно розмішують в розчині хлористого натрію, для чого пробірку з нею закривають гумовою пробкою і декілька разів перевертають вниз, а потім знову вгору. Таким чином, якщо 0,02 мл крові добавляють до 4 мл 1%-вого розчину хлориду натрію, то розводять її в 200 разів (4 мл: 0,02 мл = 200). Таке ж розве­дення крові буде і при застосуванні змішувача для еритроцитів. В ньо­го беруть кров до поділки 0,5,а 1 %-вий розчин хлористого натрію — до поділки 101. Заправлений змішувач затискують між великим та вказівним пальцями і струшують протягом 2-3 хв для перемішування крові.

В умовах практичної роботи застосовують і такий методичний прий­ом. У тварин з вуха беруть по 2-3 мл крові в пробірки з 2-3 краплями ан­тикоагулянту і 1 %-вого розчину гепарину. В лабораторії пробу крові з ге­парином готують для подальшого дослідження так, як і нативну.

В пробах крові, яку розбавили в 200 разів, підраховують кількість еритроцитів. Для цього застосовують камеру Горяєва. На її поверхню притирають накривне скло до появи райдужних кілець. З допомогою піпетки під край накривного скла поміщають краплю розбавленої крові, яка в силу капілярності заповнює камеру Горяєва. Візуально контролюють, щоб в камері під склом не було бульбашок повітря. Ка­меру ставлять на столик мікроскопа (окуляр х 10, об'єктив Х40, біно­кулярна насадка х 15) і через 1-2 хв, коли всі еритроцити осядуть і не будуть рухатись, починають їх підрахунок при зменшеному отворі діафрагми і опущеному конденсорі. Еритроцити рахують в п'яти вели­ких квадратах (в кожному з яких є по 16 малих квадратиків), розміще­них по діагоналі, бо еритроцити в камері можуть розподілятися нерівномірно 3 цією метою в полі зору мікроскопа знаходять перший великий квадрат в лівому верхньому кутку сітки і підраховують у ньому всі еритроцити. Потім камеру пересувають так, щоб в поле зору потрапив другий великий квадрат по діагоналі і т.д.

Для одержання більш точного результату прийнято підраховувати еритроцити, які розміщені не тільки в середині квадратика, а і на його лівому та верхньому боках.

При підрахунку еритроцитів враховують такі дані. Одна сторона ма­ленького квадратика сітки в камері Горяєва дорівнює 1/20 мм, а глиби­на — 1/10 мм. Тому об'єм камери над одним квадратиком складає 1/4000 куб. мм (1/20 ммх 1/20 мм х 1/10 мм).

Кількість еритроцитів в 1 мкл (куб. мм) вираховують за формулою:

Х = (Н х 4000 х 200): 80,

де X — кількість еритроцитів в 1 мкл крові;

Н — кількість еритроцитів, підрахованих в 5 великих квадратах;

4000 — коефіцієнт переводу до об'єму 1 мкл;

200 — ступінь розведення крові;

80 — кількість малих квадратиків в 5 великих квадратах.

При спрощенні ця формула має такий вигляд: Х = Н х 10000.

Висновок: ________________

________________________________

Лабораторно-практичне заняття № 24. ____________________

Тема: Підрахунок кількості лейкоцитів та тромбоцитів.

Дослід № 1. Підрахунок кількості лейкоцитів під світловим мікроскопом.

Лейкоцити, або білі клітини крові, мають у цитоплазмі ядро і їх роз­міри в декілька разів більші ніж еритроцитів. Вони беруть участь в за­хисті організму тварини від чужих антигенів (бактерій, токсинів тощо) і т.п. Кількість лейкоцитів є характерною для кожного виду тварин, але вона може змінюватися в залежності від віку, стану здоров'я, годівлі тварин та інших умов. Важливе значення для оцінки фізіологічного ста­ну тварин має не тільки підрахунок їх загальної кількості в крові, але і визначення співвідношення окремих видів лейкоцитів, їх фагоцитарної активності і інших показників.

Мета роботи.З'ясувати методику підрахунку кількості лейкоцитів у різних видів тварин.

Прилади і матеріали. Проби крові різних видів тварин, мікроскоп, пробірки, камера. Горяєва, змішувач лейкоцитів (рис. 44) або мікропіпетка місткістю 0,02 мл, 5%-вий розчин цитрату натрію, рідина Тюрка, спирт етиловий, вата, марля.

Хід роботи. Обладнання готують як і для підрахунку еритроцитів. Рідину Тюрка одержують шляхом змішування таких компонентів : 3 мл льодяної оц­тової кислоти, 1 мл 1%-вого розчину генціанвіолету, до 100 мл дисти­льованої води. В цій рідині оцтова кислота гемолізує еритроцити/а генціанвіолет — забарвлює ядра лейкоцитів.

Кров беруть з вуха тварини в пробірку з антикоагулянтом (5% -вий розчин цитрату натрію чи 1%-вий розчин гепарину), або ж її досліджу­ють в нативному вигляді, В будь-якому випадку спочатку готують роз­ведення крові в 20 разів. Для цього використовують змішувач лейко­цитів або мікропіпетку місткістю 0,02 мл. В змішувач набирають кров до мітки 0,5,а потім — рідину Тюрка, до мітки 11, У мікропіпетку наби­рають 0,02 мл крові. її кінчик витирають ватою. Кров вносять у пробірки, що мають по 0,4 мл рідини Тюрка. Мікропіпетку, не виймаю­чи з пробірки, промивають два-три рази рідиною, яка в ній знаходить­ся. Вміст пробірки добре перемішують.

На наступному етапі в розве­деній крові підраховують кількість лейкоцитів, Для цього з нею викону­ють такі ж дії, як і при підрахунку еритроцитів. Різниця полягає лише в тому, що лейкоцити рахують в ка­мері Горяєва під меншим збільшен­ням мікроскопа(окуляр х7,об'єктив х20,бінокулярна посадка х15) в 100 великих нерозкреслених квадратах (умовно 1600 маленьких). Загальну кількість лейкоцитів (в 1 мкл крові) вираховують за формулою:

Х = (Н х 4000 х 20): 1600,

де Н — кількість лейкоцитів, підрахованих в 100 великих квадратах;

4000 — коефіцієнт переводу до об'єму в 1 мкл;

20 — розведення крові;

1600 — кількість малих квадратиків камери Горяєва.

Частіше застосовують цю формулу в спрощеному вигляді^: Х=Н х 50.

Рис. 44. Лейкоцитарний змішувач.

Висновок: ________________

________________________________

Дослід № 2. Підрахунок кількості тромбоцитів під світловим мікроскопом.

Тромбоцити (кров'яні пластинки) — округлої або овальної форми клітини без ядер. В їх центрі є зернистість, яка забарвлюється метиле­новою синькою в блакитний колір. Тромбоцити беруть участь в зсіданні крові.

Мета роботи. Ознайомлення з методикою підрахунку тромбоцитів.

Прилади і матеріали. Тварини, голки для взяття крові, ножиці, мікро­скоп, змішувач для еритроцитів, камера Горяєва, розбавник для крові, етиловий спирт, ефір, 5%-вий розчин йоду, вата, марлеві серветки.

Хід роботи. Кров беруть з судин вуха тварини в змішувач для еритроцитів до мітки 0,5. її розбавляють в 200 разів розчином, який готують таким чи­ном. До 100 мл дистильованої води додають 3,8 г цитрату натрію, 0,57 г хлориду натрію, 0,15 г метиленової синьки. Розчин доводять до кипіння, охолоджують і фільтрують. Потім до нього вносять ще 2-3 краплі формаліну.

Рідину в меланжері добре перемішують і залишають у спокої на 10-15 хв для зафарбування тромбоцитів метиленовою синькою. Після цього вміст меланжера перемішують ще раз, перші 2-3 краплі видаля­ють на вату, а наступну краплю вносять під притерте накривне скло ка­мери Горяєва. Камеру розміщують на столику мікроскопа і під великим збільшенням (окуляр х 10,об'єктив Х40,бінокулярна насадка х15) ра­хують кров'яні пластинки в 25 великих квадратах, кожний з яких роз­креслений на 16 маленьких квадратиків.

Їх кількість в 1 мкл крові вираховують за формулою: Х = (Н X 4000 X 200) / 400, де Н — кількість тромбоцитів, підрахованих в 400 маленьких квадратиках.

Інші цифри формули мають аналогічне значення, як і при визначенні кількості еритроцитів чи лейкоцитів. Цю формулу краще застосовувати в спрощеному вигляді:

Х = Н х 2000.

Висновок: ________________

________________________________

Лабораторно-практичне заняття № 25. ____________________

Тема: Дослідження швидкості осідання еритроцитів. Гемоліз.

Дослід № 1. Дослідження швидкості осідання еритроцитів.

Еритроцити мають певну масу і тому можуть осідати в крові навіть тоді, коли вона оброблена з метою запобігання осіданню. Швидкість їх осідання у різних тварин різна. Вона залежить від фізико-хімічних властивостей плазми, фізіологічного стану тварини та інших умов. У здо­рових коней швидкість осідання еритроцитів складає 40-70 мм/год, у великої рогатої худоби — 0,5-1,5, у свиней — 2-9, у птахів — 1,5-3 мм/год.

Мета роботи.Ознайомитися з методикою і визначити швидкість осідання еритроцитів крові різних тварин. Вияснити вплив плазми крові на ШОЕ.

Прилади і матеріали.Кров коня, корови, кролика, курки, апарат Панченкова (рис. 45), еритроседіометр Неводова, 5%-вий розчин цитрату натрію, годинникове скло, етиловий, спирт, вата, марля.

Хід роботи 1. Швидкість осідання еритроцитів частіше визначають з допо­могою апарата Панченкова, який складається з штатива і набору капі­лярних піпеток діаметром 1 мм. На кожній піпетці є 100 поділок. В се­редині є відмітка 50 або літера Р, що означає "розчин", а в верхній час­тині на рівні 0 стоїть літера К, яка є позначкою слова "кров".

Перед роботою піпетку промивають розчином цитрату натрію. Потім його набирають до мітки Р і виливають на годинникове скло. Далі тією ж піпеткою набирають двічі кров з вуха дослідної тварини до мітки К і вно­сять на скло в розчин цитрату натрію. Кров і розчин добре перемішують піпеткою та струменем повітря, який видувають з неї. Цитратну кров бе­руть з годинникового скла в піпетку до поділки К, яку ставлять у штатив. Для цього вказівним пальцем закривають верхній кінець піпетки, а нижній ставлять на гумову прокладку приладу, яка завдяки еластичності фіксує (притискає) піпетку до верхнього бортика в вертикальному поло­женні. Реєструють час початку досліду і відмічають швидкість осідання еритроцитів через кожні 15 хв. про­тягом 1 години, а остаточний облік результатів проводять через 24 го­дини. Еритроцити, які осіли, добре видно в піпетці в вигляді темно-червоного стовпчика, а над ним — плазма блідо-жовтого кольору.

2. Швидкість осідання ерит­роцитів за Неводовим частіше визначають у коней. Для цього ви­користовують еритроседіометр, який являє собою градуйовану пробірку висотою 17 см і діамет­ром 0,8-0,9 см з поділками від 0 до 100 зверху вниз. В еритроседіо­метр вносять 15-20 мг цитрату або оксалату натрію. Кров беруть у ко­ня з яремної вени в еритроседіометр до поділки 0. Вміст змішують обе режним перевертанням пробірки декілька разів і ставлять її вертикаль­но в штатив. Результат осідання еритроцитів враховують через кожні 15 хв на протязі години.

Рис. 45.Апарат Накченкова.

Висновок: ________________

________________________________

Дослід № 2. Гемоліз.

Гемоліз — процес виходу гемоглобіну з еритроцита, внаслідок по­шкодження і руйнування його оболонки. Він відбувається під дією різних несприятливих факторів і патологічного стану організму.

Мета роботи. Ознайомлення з явищем гемолізу та причини, що його викликають.

Припади і матеріали. Кров тварин, штатив з пробірками, піпетки місткістю 5 мл, очні піпетки, концентрований розчин аміаку, етило­вий спирт (70°), 0,9%-вий розчин хлориду натрію, 0,1 N розчин НСІ, хлороформ, дистильована вода, вата, кров після одногодинної витримки в морозильній камері холодильника (-20°С).

Хід роботи. В 7 пронумерованих пробірок наливають: у першу 5 мл 0,9%-вого розчину хлориду натрію, в другу — 5 мл дистильованої води, в третю — 4 мл 0,9%-вого розчину хлориду натрію і 1 мл хлороформу, в четверту — 4 мл 0,9%-вого розчину хлориду натрію і 1 мл концентрованого розчину аміаку, в п'яту — 3 мл 0,9%-вого розчину хлориду натрію і 2 мл етилово­го спирту, в шосту — 3 мл 0,9%-вого розчину хлориду натрію та 2 мл 0,1 N розчину соляної кислоти. В сьому пробірку наливають кров, яку протягом однієї години витримали в морозильній камері холодильника (-20°С). В кожну пробірку вносять по п'ять крапель стабілізованої крові, вміст добре перемішують і залишають у штативі на 10 хв. Наявність чи відсутність гемолізу еритроцитів визначають за появою прозорості рідини та її кольором в пробірці.

Висновок: ________________

________________________________

Дослід № 3. Осмотична резистентність еритроцитів.

Резистентність — властивість еритроцитів протистояти гемолізу. Осмотична резистентність — стійкість еритроцитів до гемолізу в гіпо­тонічних розчинах. Вона є показником здатності еритроцитів проти­стояти зниженню осмотичного тиску крові.

Мета роботи.Ознайомитися з методикою та визначити осмотичну резистентність еритроцитів крові.

Прилади і матеріали.Стабілізована кров, ряд розчинів хлористого натрію (0,1 %; 0,2 %; 0,3 % і т.д. до 1,0%-вого).

Хід роботи.У кожну пробірку наливають по 5 мл розчину хлористого натрію пев­ної концентрації: від 0,1 % до 1,0 %. В пробірки додають по 2-3 краплі стабілізованої крові. Через 20-30 хвилин відмічають стан вмісту про­бірки. Прозорість рідини вказує на гемоліз, мутність — на резистент­ність (стійкість) еритроцитів до даної концентрації солі. Визначають показник максимальної резистентності еритроцитів до пониженого ос­мотичного тиску, тобто найменшу концентрацію розчину, де відсутній гемоліз.

Висновок: ________________

________________________________

Лабораторно-практичне заняття № 26. ____________________

Тема: Умови, які впливають на швидкість зсідання крові.

Дослід № 1. Умови, які впливають на швидкість зсідання крові.

Мета роботи. З'ясувати дію різних факторів на зсідання крові у однієї і тієї самої тварини.

Прилади і матеріали. Тварина, голки для взяття крові, ножиці, водя­на баня, банка з льодом, 5%-вий розчин хлористого кальцію, спирт етиловий, ефір, 5%-вий розчин йоду, вата. 5%-вий розчин цитрату натрію.

Хід роботи.Необхідні 4 чисті сухі пронумеровані пробірки; в другу пробірку нали­вають 1 мл 5%-вого розчину цитрату натрію. Заздалегідь готують водя­ну баню і банку з льодом. Після цього у тварини беруть з яремної вени по 2 мл крові в кожну пробірку. Відмічають час заповнення пробірок кров'ю і зразу розміщують пробірки в такі умови: першу і другу залишають при кімнатній температурі (20°С), третю ставлять в банку з льодом, четверту в водяну баню з температурою 38-40°С. Періодично спостерігають за кров'ю в пробірках, нахиляючи в одну сторону, і відмічають час її зсідан­ня в кожній з них. Після цього продовжують дослід з кров'ю в пробірці № 2. Пересвідчившись, що в ній кров перебуває в рідкому стані, розлива­ють її в дві пробірки рівними частинами. В першу частину крові добавля­ють 0,5 мл 5%-вого розчину хлористого кальцію і відмічають час його внесення. Вміст пробірки добре перемішують і спостерігають, що відбу­лося з кров'ю, порівнюючи її з другою частиною. Результати аналізують і роблять висновки.

Висновок: ________________

________________________________

Дослід № 2.Спостереження аглютинації еритроцитів.

Мета роботи.Провести спостереження явища аглютинації еритро­цитів.

Прилади і матеріали.Предметне скло, набір сироваток, кролик. Явище аглютинації еритроцитів використовується при визначенні груп крові. В сироватці крові є клейкі речовини — аглютиніни (аль­фа, бета), а в еритроцитах — речовини, які здатні склеюватись, аг­лютиногени (А і В). За наявністю чи відсутністю цих речовин і ділять кров на різні групи.

Хід роботи.Для виявлення явища аглютинації на предметне скло наносять по одній краплі сироватки II та III груп. Проколюють крайову вену вуха кро­лика. З допомогою предметного скла вносять краплю крові в одну краплю сироватки, а другим краєм скла — в другу краплю і старанно розмішують. Через одну-дві хвилини наступає реакція аглютинації (ге­маглютинації), тобто еритроцити склеюються і випадають в осад у ви­гляді дрібненьких грудочок, видимих неозброєним оком. За наявністю аглютинації в тій чи іншій краплині сироватки визначають групу крові.

Висновок: ________________

________________________________

Лабораторно-практичне заняття № 27. ____________________

Тема: Визначення часу зсідання крові.

Дослід № 1. Визначення часу зсідання крові.

Зсідання крові — складна захисно-пристосувальна реакція організ­му, направлена на попередження крововтрати. На процес зсідання впливає багато факторів та речовин крові. Він відбувається з різною швидкістю у різних тварин.

Мета роботи.Ознайомлення з методикою визначення швидкості зсідання крові у тварин.

Прилади і матеріали.Тварини, інструменти для взяття крові, сте­рилізатор, предметне скло, секундомір,

капронова нитка на па­личці, центрифужні пробірки, водяна баня, спирт етиловий, ефір, 5%-вий розчин йоду, вата, марлеві серветки.

Хід роботи. 1. Метод Битюкова Є. І. У хірургічний стерилізатор наливають во­ду і підігрівають її до 57°С. Замість кришки на бокові сторони стериліза­тора кладуть підставку з двох скляних паличок, з'єднаних гумовими трубками. На підставці розміщують обезжирене предметне скло, на яке наносять 1-2 краплі досліджуваної крові і відмічають час. Через кожні ЗО сек в краплю занурюють чисту суху капронову нитку, закріпле­ну підковоподібно на дерев'яній паличці або сірникові, роблять нею 2-3 рухи в середині краплі і піднімають. Як тільки за ниткою почнуть тяг­нутися волокна фібрину, то секундоміром реєструється час зсідання крові.

2. З вушної раковини тварин беруть 1 -2 краплі крові. При кімнат­ній температурі її розмішують на предметному склі. Через кожну хви­лину скло нахиляють і спостерігають за краплею крові, повторюючи цей захід до тих пір, поки в ній не утвориться згусток, який не буде змінювати форму.

Час від нанесення краплі крові на скло до формування згустка буде відповідати швидкості зсідання крові. У великої рогатої худоби кров зсідається за 5-6 хв, у свиней — за 10-15 хв, у коней — за 8-10 хв.

Висновок: ________________

________________________________

Дослід № 2. Приготування та фарбування мазків для визначення лей­коцитарної формули (лейкограми).

При оцінці фізіологічного стану організму тварин важливе значення має не тільки підрахунок загальної кількості лейкоцитів, а і визначення кількісного чи відсоткового співвідношення певних форм білих клітин крові — лейкоцитарної формули. Для цього необхідно приготувати мазки крові і пофарбувати їх.

Мета роботи. Приготувати і пофарбувати мазки крові, провести деференціацію і підрахунок різних форм лейкоцитів. Визначити лейкограму.

Прилади і матеріали. Тварини, голки для взяття крові, ножиці, пред­метне скло з шліфованим краєм, метиловий спирт, етиловий спирт, фарба Романовського-Гімза, ванночка, колба з дистильованою во­дою, ефір, 5%-вий розчин йоду, вата, марля.

Хід роботи. Кров беруть у тварин з вуха. Після проколу судини краплю крові нано­сять на край сухого обезжиреного предметного скла, яке тримають між великим і середнім пальцями лівої руки. Попереду краплі під кутом 45° підводять шліфований край накривного скла так, щоб утворений стекла­ми кут був рівномірно наповнений кров'ю (рис. 46). Рухом правої руки від себе краплю розподіляють тонким шаром по поверхні предметного скла. Ма­зок буде добрим, якщо кров розміщується на поверхні скла в вигляді рівномірної смужки, яка не виходить за його краї.

Рис. 46. Приготування мазків.

Мазок висушують на повітрі і фіксують. Для цього його кладуть у ванночку. З допомогою піпетки на нього наливають метиловий спирт на 3-5 хв, або суміш ефіру з абсолютним етиловим спиртом в співвід­ношенні 1:1 на 15-20 хв, чи хлороформ на декілька секунд. Мазок вий­мають з ванночки, висушують і фарбують одним із описаних нижче способів. Для цього беруть дві скляні палички, скріплюють їх парале­льно гумовими трубками і кладуть у вигляді підставки над ванночкою або кюветою. На ній розміщують предметні стекла мазком вверх і фарбують.

Фарбування за Романовським-Гімза, Готову фарбу попередньо розводять дистильованою водою. Для цього на кожен мл води додають 2-3 краплі фарби, її виливають на мазок, який тримають в вологій ка­мері 30-40 хв. (в залежності від температури повітря і активності фар­би). Потім фарбу змивають дистильованою водою, а препарат висушу­ють на повітрі. Добре пофарбований мазок буде рожево-фіолетового кольору, недофарбований — рожево-червоного, а перефарбований — темно-фіолетового.

Мазки крові зручно фарбувати в спеціальних пластмасових або фарфорових ванночках. Мазки ставлять у вертикальному положенні, а потім туди добавляють розведену фарбу.

Фарбування за Гіапенгеймом-Кркжовим.Цей метод вико­нується у два етапи без попередньої фіксації мазків, бо в склад фарби входить фіксуючий реактив. На першому етапі на сухий мазок налива­ють 2 мл готової фарби Май-Грюнвальда на 5 хв, а потім 2 мл дистиль­ованої води і перемішують їх за допомогою піпетки. Через 2 хв цю суміш зливають.

У другий етап на мокрий ще мазок наливають фарбу Романовського-Гімза на 20 хв, після чого її змивають дистильованою водою. Препа­рат висушують на повітрі. При такому комбінованому фарбуванні більш чітко видно зернистість і структуру ядра клітини.

Висновок: ________________

________________________________