Какие показатели характеризуют фекальное загрязнение почвы?
Определение количества бактерий группы кишечных палочек
К бактериям группы кишечных палочек (БГКП) относятся грамотрицательные, не образующие спор короткие палочки, сбраживающие лактозу и глюкозу с образованием кислоты и газа при 37 +/- 0,5° в течение 24 - 48 часов, не обладающие оксидазной активностью.
В настоящее время имеется возможность дифференцированно подходить к выбору методики определения БГКП в почве (рис.). При анализах почв, для которых предполагается невысокая степень фекального загрязнения, рекомендуется проводить определение БГКП титрационным методом. При этом возможно использование любой из двух равнозначных по эффективности сред - Кесслера-Свенертона или лактозного бульона с трифенилтетразолием хлорида (ТТХ). В качестве ускоренного метода для анализа слабозагрязненных почв рекомендуется использовать метод мембранных фильтров. При анализах проб с предполагаемой высокой степенью фекального загрязнения можно проводить прямой поверхностный посев разведений почвенной суспензии на среду Эндо.
Для исследования используются предварительно подготовленные почвенные суспензии и разведения по описанной выше методике.
Определение кишечных палочек в почве традиционным методом. Из первого разведения почвенной суспензии (1:10), прошедшей предварительную обработку, стерильной пипеткой берут 10 мл и засевают во флаконы с 50 мл жидких сред, что соответствует засеву 1 г почвы. Посев меньших количеств (0,1 г, 0,01 г и т.д.) делают по 1 мл из соответствующих разведений почвенной суспензии в пробирки с 9 мл тех же сред.
Перед посевом в каждую пробирку с лактозным бульоном прибавляют по 0,3 мл 2% водного раствора ТТХ, а в каждый флакон - по 1,5 мл. Методика с использованием ТТХ основана на способности кишечной палочки восстанавливать бесцветное соединение ТТХ в трифенилформазан, выпадающий в виде осадка и придающий среде коричневато-красный цвет. Кишечная палочка устойчива к действию формазана, в то время как развитие другой микрофлоры тормозится.
Посевы на среде Кесслера-Свенертона выращивают 48 часов при 43° или 37°. Отсутствие через 48 часов газообразования и помутнения в бродильных сосудах дает окончательный отрицательный ответ на наличие бактерий группы кишечных палочек. Отрицательный ответ на лактозном бульоне с ТТХ дается через 24 часа в том случае, если в пробирках и флаконах цвет среды не изменился.
При наличии в сосудах со средой Кесслера-Свенертона газообразования и помутнения или только помутнения производят высев на среду Эндо или на розоловый агар. Для посева на среду Эндо отбираются те сосуды с лактозным бульоном, цвет которых изменился в кирпично-красный. Чашки с посевами помещают в термостат на 24 часа при температуре 37°. Ход анализа в дальнейшем одинаков, независимо от того, какая среда использовалась первоначально.
Отсутствие роста на чашках дает окончательный отрицательный ответ. Типичными для кишечных палочек колониями являются красные, розовые с металлическим блеском, не разлагающие лактозу, и бесцветные на среде Эндо и желтые и оранжевые - на розоловой среде.
Заключительный этап исследования заключается в идентификации выросших на агаризованных средах характерных колоний, которая производится аналогично анализу кишечных палочек в воде. Из типичных колоний приготовляют мазки и окрашивают их по Граму.
У грамотрицательных палочек проверяют оксидазную активность. Постановка оксидазного теста при этом осуществляется следующим образом: петлей или стеклянной палочкой снимают колонии грамотрицательных палочек со среды Эндо и наносят штрихом на фильтровальную бумагу, смоченную специальным реактивом (пропись приготовления которого дана ниже, в разделе "питательные среды"). В месте нанесения бактериальной массы цвет бумаги не изменяется, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 1 мин., если бактерии имеют активную оксидазу. Исследование изолированных колоний является обязательным, иначе можно необоснованно отбросить кишечную палочку при ложном посинении за счет примеси оксидазоположительных бактерий. Если оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко из-за того, что мешают ингибиторы, то для получения правильного результата такие колонии можно пересеять на скошенный питательный агар и после подращивания повторить оксидазный тест.
При наличии на поверхности агаризованной среды Эндо розовых или красных колоний грамотрицательных палочек с отрицательной оксидазной активностью их подсчитывают и причисляют к бактериям группы кишечных палочек после подтверждения ферментации глюкозы. Для этого засевают 2 - 3 колонии каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4 - 5 и 18 часов инкубации при 37 °C. Если за это время в среде происходит образование кислоты и газа, то это подтверждает наличие кишечных палочек в исследуемом разведении почвы. Признаком газообразования является всплывание на поверхность среды ватного тампончика или появление пузырька газа в стеклянном поплавке; об образовании кислоты свидетельствует пожелтение среды. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного ответа через 24 часа. При отсутствии газообразования через этот срок получают окончательный отрицательный ответ, при наличии газообразования - положительный результат. Результаты анализа выражают коли-титром.
Определение кишечных палочек в почве методом мембранных фильтров. В качестве ускоренного метода для обнаружения БГКП целесообразно использовать метод мембранных фильтров. При этом через стерильные мембранные фильтры N 3 пропускают 5 - 10 мл почвенной суспензии первого разведения (1:10). Для того чтобы облегчить фильтрование почвенной суспензии через мембранный фильтр, желательно до фильтрования провести после предварительной обработки центрифугирование почвенной суспензии при 2000 об./мин. в течение 5 минут. При этом происходит осаждение крупных почвенных частиц и фильтрование почвенной суспензии происходит значительно эффективнее.
Мембранные фильтры N 3 перед употреблением стерилизуют путем кипячения в дистиллированной воде на медленном огне (во избежание скручивания фильтров). Кипячение проводят 2 раза по 20 минут, сливая каждый раз воду. После последнего кипячения воду не сливают, фильтры оставляют в воде до употребления.
По окончании фильтрования верхнюю часть прибора снимают. Мембранные фильтры с адсорбированными на них клетками бактерий осторожно захватывают обожженным пинцетом за край и накладывают на поверхность среды Эндо, налитой в чашки Петри и заранее остуженной, избегая образования пузырьков воздуха между мембранным фильтром и средой. В чашку можно поместить 4 фильтра. На чашке под каждым фильтром делают надпись с указанием номера пробы и объема профильтрованной суспензии (удобно это делать в виде дроби, например 1/5 - т.е. проба номер 1, профильтровано 5 мл и т.д.). Чашки с помещенными на них фильтрами ставят в термостат при температуре 37° на 24 часа. После инкубации отбирают 2 - 3 типичные колонии для окраски по Граму и дальнейшей идентификации, которая проводится аналогично тому, как это рекомендуется при работе титрационным методом, подробное описание которого приводилось выше.
Прямой поверхностный посев на агаризованные питательные среды для учета кишечных палочек в почве.
При анализе загрязненных и сильно загрязненных почв, отобранных в местах интенсивного фекального загрязнения, рекомендуется проводить прямой поверхностный посев почвенной суспензии в количестве 0,1 или 0,05 мл на поверхность среды Эндо обычным способом. Среда Эндо заранее разливается в чашке Петри и подсушивается в сушильном шкафу при температуре 50 - 60 °C до образования так называемой "муаровой" пленки. Возможно подсушивание чашек Петри со средойЭндо путем постепенного высушивания их при комнатной температуре. В этом случае чашки со средой Эндо оставляют на сутки на рабочем столе в положении "крышкой вниз", прикрыв их от света. Посев при анализах сравнительно чистых почв производится из разведений от 1:10 до 1:1000. При работе с загрязненными почвами обычно используют разведения до 1:1000000. Посевы выращивают в термостате при 37° в течение 24 час. Следующий этап исследований заключается в идентификации выросших микроорганизмов, который проводится аналогично определению кишечных палочек титрационным методом.
Результаты анализа последними двумя методами можно выразить в коли-титре или коли-индексе. В любом случае расчет ведется с учетом влажности анализируемой почвы. Чтобы подсчитать число клеток кишечной палочки в 1 г сырой почвы, необходимо среднее число колоний на чашке умножить на степень разведения, затем проводят перерасчет на 1 г абсолютно сухой почвы, согласно ранее приведенной формуле.