Определение гемоглобина
2.3.1 Унифицированный метод определения количества гемоглобина на гемоглобинометре фотометрическом портативном МиниГЕМ
Принцип метода: Основан на превращении гемоглобина в цианметгемоглобин при добавлении к крови реактива (р-р Драбкина). Под влиянием железисто - синеродистого калия гемоглобин окисляется до метгемоглобина (гемоглобина), который затем превращается при помощи калия в цианметгемоглобин (гемоглобинцианид).
Реактивы: 1) Трансформирующий р-р
Устройство: Гемоглобинометр МиниГЕМ 540 представляет собой специализированный фотометр, предназначенный для определения общего гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом с фотометрированием на длине волны 540 нм.
Диапазон измеряемой прибором оптической плотности составляет от 0 до 0,9. Б, что соответствует концентрации общего гемоглобина крови от 0 до 360 г/л. В приборе используется стандартная проб подготовка - 20 мкл крови, разведение 1:250. Суммарная погрешность определения гемоглобина (с учетом погрешностей дозаторов и погрешностей биохимического метода), полученная при сравнительных медицинских испытаниях, не превышает 2% (коэффициент вариации) во всем диапазоне измеряемых концентраций. При этом собственная погрешность гемоглобинометра как фотометра - не более 1%, а воспроизводимость, оцененная по коэффициенту вариации, - не более 0,25%.
Два фактора обеспечивают это качество прибора:
высокая воспризводимость характеристик раствора гемиглобинцианида, который сохраняет свои свойства при надлежащем хранении долгие годы, в т. ч. коэффициента пересчета оптической плотности в концентрацию гемоглобина (или фактора калибровки);
конструкция гемоглобинометра МиниГЕМ 540 обеспечивает высокую надежность фотометрических параметров прибора. МиниГЕМ 540 снабжен функцией саморегулирования, он обладает многолетней стабильностью измерений.
Другая отличительная особенность гемоглобинометра - полностью автоматизированная процедура фотометрирования.
Для определения гемоглобина достаточно опустить кювету с фотометрической пробой в прибор, и через мгновенье на дисплее отобразится значение концентрации. Пересчет оптической плотности раствора в концентрацию производится автоматически. Перед измерением прибор не нужно включать, "прогревать", подстраивать или калибровать. Гемоглобинометр автоматически выключится при вынимании кюветы до следующего измерения.
Третья особенность гемоглобинометра МиниГЕМ 540 - его портативность и низкое энергопотребление.
Масса прибора без батарей не превышает 300 г. Питание от сети через адаптер или от встроенных батарей. Ресурс батарей - 1 000 000 измерений, или 4 года работы.
Для контроля работоспособности гемоглобинометра используется контрольная стеклянная мера, паспортизованная для каждого прибора. Внутрилабораторный и внешний контроль качества может проводиться с помощью обычных контрольных материалов -контрольных растворов гемоглобина.
Методика измерений:
подготовить пробирки, поместив в каждую из них по 5 мл трансформирующего раствора (раствор Драбкина);
во время взятия крови в каждую пробирку перенести по 20 мкл капиллярной крови( 0,02 мл пипеткой Сали) и тщательно перемешать раствор;
через 20 мин каждую пробирку перед измерением перемешать путем переворачивания пробирки вверх вниз (время лизирования) и провести серию измерений:
Учет результата:
перелить в оптическую кювету реакционную смесь из очередной пробирки;
опустить оптическую кювету в фотометрическую ячейку прибора, при этом автоматически произойдет фотометрирование реакционной смеси, сопровождаемое звуковым сигналом, и на индикаторе появится число, соответствующее концентрации гемоглобина;
записать результат измерения.
2.3.2 Унифицированный метод определения концентрации гемоглобина на мини -фотометре MF-1020
Введение: мини фотометры являются миниатюрными настольными приборами для измерения гемоглобина крови.
Особенности прибора: цифровой индикатор, кювета открытого типа, относительная устойчивость к светорассеиванию, двухканальная оптическая схема.
Прибор показывает концентрацию гемоглобина в г/л. Светопоглощение зеленого света с длиной волны(546 нм) раствором гемиглобинцианида напрямую переводятся в единицы измерения гемоглобина. Настройка и калибровка прибора осуществляется при помощи двух ручек - « ZERO» и «CAL» . К прибору прилагается светофильтр (калибратор), назначение которого - убедиться в исправности оптических и электронных узлов и калибровки минифотометра.
Масса прибора 1 кг 300 гр.
Порядок измерения:
1.Включите прибор.
2.В течение 10 мин прогрейте.
3.Убедитесь в том, что прибор правильно откалиброван.
4.Установите кювету с холостой пробой реагента трансформирующего раствора. 5.С помощью ручки « ZERO» на цифровом индикаторе установите нулевое значение. 6.Приготовьте кровь, разбавив ее 1:251 с трансформирующим раствором и проведите измерение.
Приготовление пробы:
1 .Двадцать микрометров крови (0,02 мл) необходимо разбавить в 5 ,0 мл трансформирующего раствора р-ра Драбкина- 1:21
2.Хорошо перемешайте (встряхните). Прежде чем приступить к измерению, подождите 5-10 мин, особенно если реагент не содержит детергент.
Калибровка минифотометра по стандартному р-ру гемиглобинцианида
Вставьте кювету, содержащую трансформирующий реактив (р-р Драбкина) в кюветный отсек.
При помощи ручки « ZERO» установите нулевое значение в цифровом табло.
Вставьте кювету, содержащую стандартный р-р гемиглобинцианида, в кюветный отсек.
При помощи ручки « CAL» установите данное значение стандартного калибровочного р-ра в цифровом табло (пример 150 г/л).
Повторите процедуру калибровки от пункта 1 до пункта 4.
Калибровка окончена, и Вы можете приступить к измерению
Калибровка минифотометра при помощи калибратора (по фактору)
1.Вставьте калибратор со светофильтром в кюветный отсек таким образом, чтобы была
видна надпись «ZERO» с цифровым значением (например, 0.1.6)
2.При помощи ручки «ZERO» установите это значение (п.п.0.1.6) в цифровом табло.
3.Переверните калибратор и вставьте его в кюветный отсек таким образом, чтобы
была видна надпись «CAL» с калибровочным значением (пример 159).
4.При помощи ручки «CAL» установите данное значение на цифровом табло.
Повторите процедуру от пункта 1 до пункта 4.
Калибровка окончена, и Вы можете приступать к измерениям.
Требования к реактивам:
1.Любая модификация р-ра пригодна для применения.
2.Разбавление 10 мкл крови в 2,5 мл трансформирующего не пригодно для этой модели.
3.Можно приготавливать самим р-р-1 раз в месяц, хранится в посуде из темного стекла.
2.3.3 Унифицированный метод определения гемоглобина на фотоэлектроколориметре
Принцип метода: Гемоглобин, взаимодействуя с ацетонциангидрином, в присутствии железосинеродистого калия K3[Fe(CN)6] образует гемиглобинцианид красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию гемоглобина в пробе крови.
Реактивы: 1) трансформирующий раствор (0,5 мл ацетонциангидрина, 0,2 г железосинеродистого калия, 1 г гидрокарбоната натрия NaHCb растворяют в 1 л дистиллированной воды; реактив стоек, хранится в посуде из темного стекла); 2) стандартный раствор гемиглобинцианида (раствор, выпускаемый фирмой «Ренал», содержит 59,75 мг% гемиглобинцианида; раствор фирмы «Иммуна» —64,23 мг%. Это соответствует концентрации гемоглобина в крови 150 и 154 г/л при разведении ее в 251 раз).
Ход определения. К 5мл трансформирующего раствора добавляют 0,02 мл (капилляр Сали) крови. При этом кровь разводится в 251 раз. Оставляют пробирки на 20 мин при комнатной температуре.
Фотометрируют при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм (1 см) против дистиллированной воды.
Стандартный раствор фотометрируют при тех же условиях, что и опытную пробу.
Расчет. Содержание гемоглобина определяют по калибровочному графику, который строится по стандартному раствору гемиглобинцианида или по формуле:
С=Е о/ Е к х 120
Где С- концентрация гемоглобина в опытной пробе, г/л
Ео - оптическая плотность опытной, ед. опт. Плотность
Ек- оптическая плотность калибровочной пробы, ед.плот.
120-концекнтрация гемоглобина кВ калибровочном растворе, г/л.
Приготовленные разведения фотометрируют. против дистиллированной воды («холостая» проба).
Подсчет эритроцитов
