Проверка гипотез экспериментами.
Гипотеза соматических мутаций. Август Вейсман в 90ые годы 19 века, соавторы В.Ру, Негели. Это теория неравнонаследственных делений клеток. Вейсман первым высказал мысль, что наследственным веществом является хроматин. Он предполагал, что в ходе делений дробления хроматин распределяется между бластомерами неодинаково. Он опирался на данные о диминуции хроматина, которая наблюдается при дроблении у аскариды. В этом случае полностью наследственная информация сохраняется только в предшественнике половых клеток.
Проверка этой гипотезы.Шпеман перетянул яйцеклетку тритона до начала 1го деления дробления. Половинка зародыша с ядром дробилась, а безъядерная – нет. На стадии 16 бластомеров Шпеман, ослабив петлю, пропускал одно ядро во безъядерную половину. Там начиналось дробление. Формировалось два зародыша со всеми органами. Этот опыт показывает, что неравнонаследственного деления нет.
Однако эти опыты не решали полностью эту проблему.Лучшим доказательством послужили опыты американского ученого Стьюарта, который вырастил полноценное растение из одной единственной клетки флоэмы взрослого растения (морковь).У животных пока этого не получилось. Однако опыты с пересадками ядер в энуклеированную яйцеклетку показывают эквивалентность генома дифференцированных клеток. Такие опыты были произведены в 50х г прошлого века английскими учеными Бриггсом и Кингом, а затем Гёрдоном на яйцеклетках лягушки. Был получен ряд выводов. Оказалось, что способность трансплантируемых ядер вызывать нормальное развитие понижается с возрастом животного. Однако, было показано достоверно, что ядра дифференцированных клеток способны обеспечивать развитие и дифференцировку совершенно других типов эмбриональных тканей.
Наиболее прямые доказательства эквивалентности геномов большинства соматических клеток были получены с помощью гибридизации нуклеиновых кислот. Было показано, что ДНК всех типов клеток мыши имеют одинаковое количество и одинаковые типы последовательностей нуклеотидов.
Однако, гипотеза соматических мутаций, как частный, но очень важный случай при дифференцировке, тоже получила свое подтверждение. Это - дифференцировка В-лимфоцитов, продуцирующих антитела. Существует более миллиона клонов этих клеток, различающихся по продуцируемым антиталам. Возникают они благодаря тому, что в тех участках их генома, которые кодируют белки антител (иммуноглобулины), происходят перемещения (транслокации) определенных групп генов.
Уровень транскрипции (дифференциальная активность генов).
Участие уровня транскрипции в регуляции клеточной дифференцировки не вызывает сомнений. Это было показано црежде всего с помощью цитологических методов. Оказалось, что способность к синтезу РНК не распределена равномерно по всей хромосоме. В ней существуют более и менее активные участки. Примером этого могут служить хромосомы типа ламповых щеток у ооцита. Синтез м-РНК идет только на петлях этих хромосом, а амплификация генов и синтез р-РНК идет на других участках. Другим доказательством дифференциальной активности генов было открытие так называемых пуфов в политенных хромосомах слюнных желез двукрылых насекомых (дрозофила). Пуфы, как и «ламповые щетки», представляют собой расплетенные деконденсированные участки хромосом. Мощность и положение пуфов изменяются под действием гормонов. Это было первым открытием того, что внешние факторы, в данном случае гормоны, непосредственно влияют на синтетическую активность генов.
Самые удивительные данные, говорящие о дифференциальной активности генов, были получены на зародышах дрозофилы. На них с помощью метода гибридизации in situ были получены карты –автографы экспрессии определенных генов и было показано, что при развитии в определенных местах зародыша включаются определенные гены. Установлено, что белки, закодированные генами, которые включаются в развитии раньше, являются активаторами для последующих групп генов. В еще неоплодотворенной яйцеклетке с помощью дифференциальной активности генов происходит разметка всего строения будущего зародыша и затем личинки.
Во время оогенеза клетки-кормилки (т.е. питающие клетки) и фоликулярные клетки у переднего полюса продуцируют м-РНК белка bicoid, а фолликулярные клетки на будущей вентральной поверхности зародыша транспортируют белок, который активирует трансмембранный рецептор Toll, размечая тем самым пространственные характеристики будущего зародыша. В результате ооцит приобретает передне-заднюю и дорзо-вентральную поляризацию. Устанавливается градиент концентрации белка bicoid с максимумом на переднем конце яйцеклетки.
После оплодотворения и начале дробления в зародыше последовательно активируются группы генов, и эта активация происходит вдоль передне-задней оси. Через 1 час после оплодотворения начинается активация генов группы gap (щель, разрыв). Уровень их активации зависит от концентрации белка bicoid. При мутации генов gap образуется зародыш, в котором «пропущены» большие участки, т.е. получается «разрыв» тела.
Через 2 часа начинается экспрессия генов pair-rule (двойное правило), которые устанавливают положение сдвоенных сегментов: каждая полоса экспрессии определяет ширину двух образующихся позже сегментов тела личинки. Через 2,5 часа начинается экспрессия генов группы segment polarity. Они определяют окончательную сегментацию зародыша, а следовательно и личинки. Затем начинают работать гомейозисные гены (Hox-гены), которые устанавливают точное развитие каждого сегмента. Мутации по этим генам изменяют строение сегментов и связанных с ними придатков (крыло, жужжальце, конечности, щупальцы, челюсти,глаза, антенны). Работа Нох-генов изучена очень хорошо. У этих генов наблюдается корреляция между их положением в хромосоме (от 3’- к 5’ концу нити ДНК) и их экспрессией от переднего к заднему концу тела.Эта закономерность прослеживается от пресноводной гидры до человека и показывает важность Нох-генов в развитии всех животных.
Все эти последовательно работающие гены составляют единую цепь: ранее включенные гены являются активаторами для последующих генов. Аналогичные карты экспрессии генов были получены для зародышей морского ежа.
Разметка осуществляется и в вентро-дорзальном направлении. На дорзальной стороне активируется ген dpp, белок которого аналогичен белку BMP, а на вентральной стороне - ген sog. Его белок аналогичен белку chordin.
Следует сказать, что нервная система у насекомых возникает на вентральной стороне. Учитывая это, можно считать, что молекулярно-генетические данные подтверждают представление о том, что дорзальная сторона зародышей позвоночных гомологична вентральной стороне членистоногих (и вообще всех первичноротых). Это совпадает с высказыванием французского зоолога Жоффруа Сент-Илера (все три слова обозначают одну фамилию и учение этого ученого называется «жоффруизм») о том что позвоночные –это «перевернутые первичноротые» (начало 19 века).
По-видимому, дифференциальная активность генов один из основных уровней регуляции. Дифференциально экспрессируются как правило, не отдельные гены, а целые группы (блоки) генов. Активность этих генов является самоподдерживающейся. Будучи один раз активированными, они затем спонтанно поддерживают свою активность на определенном уровне. Этим может быть объяснена высокая устойчивость многих типов клеток.
На примере формирования нервной системы у дрозофилы рассмотрим молекулярные механизмы межклеточных взаимодействий, происходящих во время органогенезов.
На вентральной стороне формирующейся личинки происходит расчленение единого слоя гиподермы (эктодермы) на предшественники нервных и эпителиальных клеток. При этом отдельные клетки (предшественники нервных) мигрируют внутрь под гиподерму и начинают неравномерно делиться, давая начало отдельному ганглию брюшной нервной цепочки. Клетки, остающиеся на поверхности, превратятся в поверхностную эктодерму. При мутации Notch все клетки эктодермы превращаются в нервные и это естественно приводит к гибели личинки. Исследование молекулярно-генетических механизмов формирования нервной системы дрозофилы показало, что в этом случае работает генетическая система Delta-Notch. Белок Notch является трансмембранным рецептором, а белок Delta – его лигандом.
Предшественником нервной клетки становится та клетка эктодермы, в которой, по невыясненным причинам, раньше и более активно начинает работать ген Delta. Его белок выделяется наружу и действует на рецепторы Notch окружающих клеток. Соединяясь с рецептором Notch, молекулы Delta, расщепляют его на три отдельные фермента. Внутренний (цитоплазма-тический) фрагмент входит в ядро и активирует гены, которые ответственны за эктодермальную дифференцировку. Таким образом создается клеточный ансамбль, в центре которого находится клетка, активно синтезирующая белок Delta и «обреченная» стать нервной клеткой. Она выделяет этот белок, который при взаимодействии с рецепторами Notch соседних клеток превращает последние в эктодермальные. Распространение белка Delta ограничено, поэтому на некотором расстоянии другая клетка с активным синтезом этого белка становится нервной и образует вокруг себя венчик эпителиальных клеток и т.д.
Возникает ряд клеток-предшественников нервных клеток, отделенных друг от друга эпителиальными. В случае мутации Notch специфические рецепторы отсутствуют, клетки не могут принимать сигналы от соседних клеток и поэтому запрет на формирование нервных клеток отсутствует, Тогда все поверхностные клетки превращаются в нервные. Таким образом, на поверхности зародыша оказывается расположенной нервная ткань.
Уровень трансляции
Регуляция на этом уровне в развивающихся зародышах проявляется в основном в задержках трансляции с уже заготовленных молекул мРНК. Это характерно для оогенеза, когда заготавливается масса различных мРНК, которые в ходе дробления будут вступать в трансляцию по определенной пространственно-временной программе. У моллюсков, например, фактор, регулирующий скорость трансляции связан с полярной лопастью. Регуляция на уровне трансляции имеет место при синтезе гемоглобина.
Новый способ регуляции на уровне трансляции, РНК-интерференция, открыт при изучении развития Caenorhabditis elegans. Для его нормального развития необходимо подавлять деление стволовых клеток на определенных стадиях развития, чтобы не возникало лишних клеток. (Как известно, взрослый организм С.е. состоит из 959 клеток). Это подавление достигается тем, что активируются определенные гены и благодаря последующему сплайсингу возникают короткие молекулы РНК (22 нуклеотида). Они связывают комплементарные молекулы РНК, которые перед этим активно транслировали белки, необходимые для деления стволовых клеток. Это связывание приводит к подавлению трансляции. РНК-интерференция обнаружена и в эмбриональных стволовых клетках мыши.
Посттрансляционный уровень.
После завершения трансляции вновь синтезированный полипептид, прежде чем стать функционально активным, проходит многочисленные превращения. Роль этих модификаций в регуляции клеточной дифференцировки изучена ещё недостаточно, но она очень важна при формировании надмолекулярной организации клеток. Это связано с изменением третичной структуры белка или с образованием четвертичной. В конечном счете белок перемещается к окончательному месту своего функционирования –происходит так называемая адресация- и встраивается, например, в плазматическую мембрану или в другую надмолекулярную структуру.