Основные этапы первичного гемостаза.

В месте повреждения сосудистой стенки запускается тромбоцитарно-сосудистый механизм остановки кровотечения, основу которого составляют спазм сосуда, адгезия клеток (прежде всего кровяных пластинок), дегрануляция тромбоцитов, а также их агрегация и формирование тромба. Главная задача тромбоцитарно-сосудистого гемостаза – формирование белого тромба и закрытие дефекта сосудистой стенки. Последовательность событий отражена на схеме (рис.4).

1. Спазм артериол. Различают начальный и отсроченный спазм. Первый возникает сразу после повреждения сосудистой стенки, продолжается несколько секунд, механизм его развития — рефлекторный. Причиной отсроченного спазма являются биогенные амины, которые освобождаются тромбоцитами — катехоламины, серотонин. Но главным механизмом местного спазма повреждённого сосуда считается действие системы эндотелинов, а также ослабление продукции оксида азота и простациклина.

Рис. 4. Схема сосудисто-тромбоцитарного механизма гемостаза.

2. Адгезия тромбоцитов— прилипание и распластывание тромбоцитов на коллагене базальной мембраны. Это первая ступень формирования белого тромба.

Основной причиной адгезии тромбоцитов является обнажение коллагена вследствие повреждения эндотелия и появление молекулярных активаторов адгезии и агрегации. Различают доконтактную и контактную фазы адгезии тромбоцитов. Еще до контакта с поврежденной стенкой сосуда, в крови происходит первичная активация тромбоцитов. Сначала изменяется форма тромбоцитов от дискообразной к сферической, а затем появляются длинные нитеобразные отростки (от 3 до 10 в каждом тромбоците).

Во время контактной фазы происходит взаимодействие рецепторов активированных тромбоцитов с элементами базальной мембраны сосудистой стенки, несущей адгезивные лиганды. При этом имеют значение:

а) непосредственный контакт рецепторов тромбоцитов (ГП Ia-IIa) с коллагеном;

б) контакт тромбоцитарных гликопротеинов (ГП Ib) с коллагеном сосудистой стенки через фактор фон Виллебранда;

в) реверсия электрического заряда интимы при ее повреждении (заряд меняется с "-" на "+"), в результате чего возможно электростатическое взаимодействие тромбоцитов, имеющих отрицательный поверхностный заряд, со стенкой сосуда;

г) замедление кровотока в поврежденном сосуде из-за спазмирования.

Тромбоциты прикрепляются к коллагену сосудистой стенки через гликопротеиновый рецептор Ia-IIa. Дополнительной точкой опоры при адгезии со стороны сосуда служит фактор фон Виллебранда, который связан с местным коллагеном и фибронектином, а со стороны тромбоцита с гликопротеином Ib (CD₄₂). Дополнительная фиксация осуществляется путём образования мостика из тромбоцитарного рецептора СD₅₁ и васкулярного белка витронектина. Эти взаимодействия активирует тромбоциты и приводят к появлению на поверхности клеток большого количества рецепторов IIb-IIIa (данный гликопротеин называется цитоадгезин), способствуя агрегации.

Таким образом, фактор фон Виллебранда служит адаптером для прикрепления тромбоцитов к коллагену сосудистой стенки и друг к другу. При повреждении сосуда или активации эндотелия фактор Виллебранда выделяется в кровь и может служить маркёром этих процессов (рис. 5).

Молекулярные взаимодействия приводят к активизации тромбоцитов- происходит активация тромбоцитарных гликопротеинов и фосфолипаз, стимулируется обмен фосфолипидов, образование вторичных посредников, фосфорилирование белков, метаболизм арахидоновой кислоты, взаимодействие сократительных белков, перераспределение ионов кальция, экспрессия фибриногеновых рецепторов.

Рис. 5. Адгезия и агрегация тромбоцитов.

Фосфатидилинозитоловые посредники и протеинкиназа С, нарастающая внутриклеточная концентрация ионов кальция, обеспечивают сокращение цитоскелета тромбоцита, форма пластинок меняется, они распластываются и образуют тромбогенный «псевдоэндотелий» на месте дефекта (стадия распластывания). Параллельно важные события идут в цитоплазме, исчезает деление на гиаломер и грануломер. Цитоскелет кровяных пластинок перегруппировывает их гранулы, а консистенция цитоплазмы делается из золеобразной всё более гелеподобной. Этот процесс- «вязкий метаморфоз» подготовительный этап к освобождению содержимого гранул и, одновременно, средство повышения механической прочности образующегося белого тромба.

3. Реакция высвобождения — дегрануляция тромбоцитов. Это специфический Са²⁺-зависимый секреторный процесс, при котором кровяные пластинки выделяют ряд веществ в экстрацеллюлярное пространство. Как адгезия, так и агрегация тромбоцитов могут приводить к развитию реакции высвобождения. Адгезия тромбоцитов усиливает их активность, что приводит к запуску агрегации (первичная волна) и секреции кровяными пластинками содержимого своих гранул, а собственные агонисты, высвобождаемые из гранул тромбоцитов, усиливают агрегацию (вторичная волна), то есть запускается аутокаталитический процесс. Индуцируют реакцию высвобождения АДФ, адреналин, субэндотелиальная соединительная ткань и тромбин. Вначале высвобождается содержимое плотных δ (дельта) гранул (содержат биогенные амины, АДФ, Са²⁺) – реакция раннего высвобождения. Для выделения содержимого α (альфа) гранул (содержат ряд уникальных и неспецифических пептидных медиаторов коагуляции, антикоагуляции, воспаления, регенерации и иммунитета), необходима более интенсивная стимуляция тромбоцитов (позднее высвобождение). После опустошения этих гранул агрегация усиливается. Лизосомальные гранулы, содержащие кислые гидролазы, высвобождаются только в присутствии коллагена или тромбина. При повреждении тромбоцитарных мембран из пластинок выделяется содержимое пероксисом.

4. Агрегация тромбоцитов — слипание кровяных пластинок, составляет следующую ступень формирования белого тромба. Обычно различают двойную волну агрегации. Первичная волна (агрегация I) зависит от экзогенного АДФ, а вторая волна (агрегация II) наблюдается после высвобождения собственных проагрегантов. При анализе агрегатограмм обращают внимание на общий характер агрегации (одноволновая, двуволновая; обратимая, необратимая; полная, неполная).

Агрегацию тромбоцитов вызывают различные по своей природе вещества: тромбин, коллаген, АДФ, арахидоновая кислота, тромбоксан А₂, простагландины G₂ и H₂, серотонин, адреналин. Важный результат агрегации – создание фосфолипидно-гликопротеидного ложа для быстрейшего фибринообразования.

Наибольшее значение с функциональной точки зрения имеют следующие проагреганты:

а) АДФ. Освобождается из поврежденных клеток сосудистой стенки, гемолизированных эритроцитов, тромбоцитов в процессе их активации;

б) тромбоксан А₂ и арахидоновая кислота. Тромбоксан А₂ является продуктом циклоксигеназного пути превращения арахидоновой кислоты в тромбоцитах – усиливает спазм сосудов, адгезию и активацию тромбоцитов через снижение уровня тромбоцитарного цАМФ;

в) биогенные амины — адреналин, серотонин. Их источниками являются плазма крови и тромбоциты;

г) фактор агрегации тромбоцитов (ФАТ). Является веществом липидной природы, выделяется эндотелиоцитами, тучными клетками, базофилами и нейтрофилами крови;

д) тромбин. Является мощным агрегантом в дозах, зйачительно меньших по сравнению с теми, которые вызывают свертывание крови. Такие малые количества тромбина всегда образуются благодаря внешнему механизму свертывания крови в местах повреждения сосудистой стенки за счет выделения тканевого тромбопластина;

е) тромбоспондин. Освобождается из активированных тромбоцитов, адсорбируется на их мембране, взаимодействует с белками крови.

· АгрегацияI.

При адгезии тромбоцитов на стадии распластывания под воздействием внешних проагрегантов начинается агрегация (рис.6).

Рис.6. Активированный тромбоцит.

В активизированном тромбоците повышается концентрация кальция и происходит:

1) сокращение микрофибрилл, в результате чего образуются длинные нитеобразные отростки и начинается уплотнение «вязкий метаморфоз»;

2) усиление гидролиза АТФ, следствием чего является образование мощного агреганта — АДФ;

3) выброс содержимого гранул тромбоцитов (сначала плотных, затем –α);

4) активация фосфолипазы А₂, что вызывает образование арахидоновой кислоты, а затем и тромбоксана А₂.

Тромбоцитарный АДФ, тромбоксан А₂, клейкие гликопротеиды, фибриноген обеспечивают процесс тромбоцитарной агрегации (слипание тромбоцитов). Под влиянием проагрегантов тромбоцитарный гликопротеин IIb-IIIa меняет конформацию и начинает активно связывать γ-цепь фибриногена, соединяясь с другими кровяными пластинками посредством фибриногенового мостика. Тромбоспондин стабилизирует фибриноген-тромбоцитарные мостики, знаменуя собой очередной этап формирования белого тромба – рыхлая агрегация. На этом этапе агрегация может быть прекращена, тромбоциты еще не повреждены. На мембране тромбоцитов экспрессируется из мембран α-гранул Р-селектин, фиксатор лейкоцитов. Белые кровяные клетки привлечённые АДФ и 4 тромбоцитарным фактором включаются в процесс агрегации и входят в состав белого тромба. При этом происходит белковое склеивание — образование "мостиков", состоящих из белков плазмы крови. Эти белки получили название плазменных кофакторов агрегации. К ним относятся фибриноген, альбумины, агрексоны А и В. Все эти белки склеивают тромбоциты благодаря взаимодействию с гликопротеиновыми рецепторами тромбоцитов (известно 5 типов таких рецепторов). и тромбоспондином — агрегантом, адсорбированным на тромбоцитарной мембране.

· Агрегация II.

Под влиянием медиаторов, высвобождаемых из тромбоцитов, агрегация усиливается и делается необратимой. Экспозиция тромбогенных фосфолипидов активирует систему коагуляционных белков. Активизированные тромбоциты экспрессируют на поверхности рецепторы V и VIIIС факторов свёртывания, что даёт им возможность служить каталитической поверхностью для сборки начальных комплексов внутреннего каскада коагуляции. Агрегированные тромбоциты своими отростками соединяются с нитями фибрина, находящимися в плазме и образующими сеть вокруг агрегированных клеток. Нити фибрина-полимера, стабилизированные XIII фактором свёртывания прочно оплетают агрегированные тромбоциты, связывая их с эндотелием и делают агрегацию необратимой. В этот период тромбоциты повреждаются, экспозируют мембранный фосфолипопротеид (3ф.тр) и погибают. Считают, что основной причиной необратимой агрегации является локально образующийся тромбин и фибрин.

5. Консолидация тромба — его укрепление, в результате чего формируется окончательный тромбоцитарно- лейкоцитарный тромб.

Поперечные сшивки между фибриновыми нитями, фактически создают микроаналог системы мышца-сухожилие. Под влиянием тромбина происходит освобождение тубулярной системой тромбоцитов – аналог саркоплазматического ретикулюма – ионизированного кальция, снимающего блок обьединения актина и миозина. Актомиозиновый комплекс тромбоцита (ранее условно именовавшийся как «ретрактозим») сокращается и расщепляет АТФ, тромбоциты стягивают фибриновые нити и добиваются ретракции. Ретракция требует не только тромбостенина кровяных пластинок, но и фибрина, образующегося на поверхности тромбоцитарно-лейкоцитарной пробки и играющего опорную роль. На этом завершается цепь процессов, известных как появление белого тромба.

Коагуляционный гемостаз.

Факторы свёртывания крови.

Свертывание крови (коагуляция) является сложным многоэтапным ферментативным процессом, который в конечном итоге заканчивается образованием фибринового сгустка. Основу процесса свертывания крови составляют реакции протеолиза, в которых прямо или косвенно принимают участие 13 основных факторов свертывания, 3 дополнительных и фактор тромбоцитов 3 (мембранный фосфолипопротеид). Все они за исключением ф. Ш имеют плазменное происхождение.

К факторам свертывания крови относятся: ф.I — фибриноген, ф.II— протромбин, ф.III — тканевой тромбопластин, ф.IV — ионы кальция; ф.V — проакцелерин, ф.VП — проконвертин, ф.VШ — антигемофилъный глобулин А, ф.IХ — фактор Кристмаса (антигемофилъный фактор В), ф.Х — фактор Стюарта-Прауэра, ф.ХI — фактор Розенталя (антигемофилъный фактор С), ф.ХII — фактор Хагемана (фактор контакта), ф.ХIII — фибрин-стабилизирующий фактор. Дополнительные: фактор фон Виллебранда, фактор Флетчера (плазменный прекалликреин), фактор Фитцджеральда (высокомолекулярный кининоген).

По функциональным свойствам все факторы, принимающие участие в свертывании крови, можно подразделить на следующие группы:

1. Белки-ферменты. Это в основном сериновые протеазы: (факторы II, VII, IX, X, XI, XII, прекалликреин). Один фактор (ф.ХIII) является трансглутаминазой (фибринолигаза). Все указанные ферменты содержатся в крови и тканях в неактивной форме. Их активация достигается протеолитическим отщеплением пептидов, закрывающих активный центр ферментов. Такое отщепление происходит при участии активированного предыдущего фактора свертывания (активной протеазы). Таким образом, реакции активации свертывания крови имеют каскадный, цепной характер.

2. Неферментные белки — акцелераторы (белки-ускорители). К ним относятся ф.V, ф.VШ и кининоген с высокой молекулярной массой. Эти факторы в сотни раз ускоряют ферментативные реакции свертывания крови. В отличие от ферментов они потребляются в процессе коагуляции крови.

3. Фосфолипидная матрица(микромембрана), на которой происходят упорядоченные реакции свертывания крови (тканевой фактор, ф.III, тромбопластин - служит и рецептором и кофактором ступенчатого протеолиза). Роль такой матрицы могут выполнять:

а) фактор 3 тромбоцитов;

б) фосфолипидные фрагменты мембран поврежденных клеток;

в) фосфолипидные фрагменты мембран гемолизированных эритроцитов.

4. Ионы кальция. Их участие в свертывании крови состоит в фиксировании белковых факторов к фосфолипидным матрицам.

5. Субстрат свертывания крови — фибриноген (ф.I) из которого образуется конечный продукт каскада свёртывания крови фибрин. Большинство факторов свертывания синтезируется в печени. Их разделяют на две группы:

а) витамин К-зависимые: ф.П, VII, IX, X. Витамин К в коферментной форме входит в состав печеночных карбоксилаз, которые принимают участие в образовании указанных факторов;

б) витамин К-независимые: ф.I, V, XI. Их образование не требует витамина К.

Фазы свертывания крови.

Процесс свертывания крови - это целая цепь последовательных ферментативных реакций, в которой проферменты, активируясь, способны активировать другие факторы свертывания крови. Удобно рассматривать схему коагуляции в виде каскада ферментативных реакций, условно разделенного на внутренний и внешний пути. Конечным продуктом коагуляционных реакций и по внешнему и по внутреннему пути является фибрин. Образование фибрина происходит в три этапа, поэтому коагуляционный гемостаз можно условно разделить на 3 фазы (рис. 7).

Рис.7. Коагуляционный механизм гемостаза.

1 фаза - образование протромбиназы или контактно-калликреин-кинин-каскадная активация. Эта фаза представляет собой многоступенчатый процесс, в результате которого в крови происходит накопление комплекса факторов, способных превратить протромбин в тромбин, поэтому этот комплекс называется протромбиназой. Образование протромбиназного комплекса- наиболее сложный и длительный этап фибринообразования. Различают внутренний и внешний пути формирования протромбиназы.

2 фаза – образование тромбина.

3 фаза – образование фибрина.

Неактивированные факторы, или белки-предшественники обозначены римскими цифрами, а активные с добавлением общепринятого символа «а». Ниже представлено два независимых пути активации коагуляционного гемостаза. Оба каскада приводят к активации фактора X и продукции тромбина, далее следует превращение фибриногена в фибрин.

Внешний путь коагуляции

Внешний каскад свертывания запускается в ответ на повреждение тканей и предполагает обязательное наличие тканевого тромбопластина (фактора III) – фосфолипопротеид, высвобождающийся из мембран клеток тканей и эндотелия, а также из активированных тромбоцитов и способный адсорбировать активированные плазменные факторы свёртывания. Все процессы коагуляционного гемостаза разворачиваются на фосфолипидной поверхности тромбопластина. Старт коагуляции начинается с активации фактора VII на клеточной поверхности (ф. III). Активированный фактор VII переводит фактор X в Xа и активирует фактор IX (активация фактора IX идет медленно и существенной роли в коагуляции не играет). Комплекс (Xа + Vа + ионоы Са++ и фосфолипиды) – активная протромбиназа, которая переводит протромбин в тромбин. Образование тромбина инициируется по внешнему пути очень быстро (в течение секунд), что ведет к появлению первых порций тромбина, активирующих другие коагуляционные факторы (VIII, V, XIII и др.).

Внутренний путь коагуляции

Запуск коагуляции по внутреннему пути начинается с активации фактора Хагемана (XII) и происходит на фосфолипидных мембранах тромбоцитов.

Фактор Хагемана активируется при контакте с полианионными поверхностями и некоторыми компонентами повреждённого сосуда - коллагеном, фосфолипидами или калликреином. Активированная молекула фактора Хагемана вызывает активацию его субстратов: прекалликреина (ПК), высокомолекулярного кининогена (ВМК) и ф. XI. ПК и ф. XI связываются с активирующей поверхностью посредством ВМК. Без ВМК активации обоих проферментов не происходит. Связанный ВМК может расщепляться калликреином или связанным с поверхностью ф.XIIа и инициировать взаимную активацию систем ПК- ф.XIIа.

Затем связанный с поверхностью ф.XIIа преобразует фактор XI в XIа и прекалликреин до калликреина. Механизм взаимной активации ф.XII и прекалликреина обеспечивает многократное усиление системы активации ф.XII. Образовавшийся калликреин превращает ВМК в ВМКа и брадикинин. В результате этих первых контактных реакций комплексы ВМКа/К и ВМК/ф. XIа размещаются вблизи ф.XIIа, где начинается активация процесса свёртывания крови, фибринолиз и активация комплемента. В свою очередь, фактор XIа активирует фактор IX. Фактор IXа на фосфолипидных мембранах с участием фактора VIIIа и ионов Са++ путем протеолиза превращает фактор X в его активированную форму. Эту реакцию значительно ускоряют коагуляционный фактор Vа и фосфолипиды. Комплекс (Xа + Vа + ионоы Са++ и фосфолипиды) – активная протромбиназа, которая переводит протромбин в тромбин.

Конечный этап коагуляции.

Переход фибриногена в фибрин происходит следующим образом: от фибриногена тромбин отщепляет фибринопептид А и фибринопептид В. Так образуется фибрин-мономер, затем мономеры скрепляются в агрегатах, идёт полимеризация и образуется рстворимый фибрин (s). Фибрин-стабилизирующий фактор XIIIа (активированный тромбином) в присутствии Са++ способствует образованию в фибрин-полимере перекрёстных сшивок и превращает фибрин-полимер из растворимой формы в нерастворимую, составляющего основу кровяного сгустка (is-фибрин) (рис. 8).

Рис.8. Образование фибрина и фибринолиз.

После стабилизации фибрина, образующего первичный красный тромб, начинаются два основных процесса посткоагуляционной фазы – спонтанный фибринолиз и ретракция, приводящие в итоге к формированию гемостатически полноценного окончательного тромба.