Хроматографические методы анализа

Теория вопроса, значение и принцип метода.Хроматография – метод разделения, обнаружения и определения веществ на основе различного их поведения в системе из двух несмешивающихся фаз – подвижной и неподвижной. Это наиболее распространённый, надёжный и универсальный метод разделения самых разнообразных смесей.

Наиболее широко хроматографию используют при разделении сложных смесей веществ (нефть, лекарственные препараты, вещества растительного происхождения, кровь и т.д.).

Сущность метода состоит в перемещении подвижной фазы, содержащей компоненты разделяемой смеси, относительно неподвижной. Подвижной фазой может быть жидкость (раствор анализируемой смеси веществ) или газ (смесь газов или паров веществ), неподвижной фазой – твёрдое вещество или жидкость, адсорбированная на твёрдом веществе, которое называют носителем. При движении подвижной фазы вдоль неподвижной компоненты смеси сорбируются на сродном веществе к материалу неподвижной фазы. Поэтому неподвижную фазу называют также сорбентом. Захваченные сорбентом молекулы могут перейти в подвижное состояние и передвигаются с ней дальше, затем снова сорбируются. Таким образом, происходит распределение молекул компонента между двумя фазами. Чем сильнее сродство компонента к неподвижной фазе, тем сильнее он сорбируется и дольше задерживается на сорбенте, тем медленнее его продвижение вместе с подвижной фазой. Компоненты смеси обладают разным сродством к сорбенту, поэтому при перемещении смеси вдоль сорбента происходит разделение: одни компоненты задерживаются вначале пути, другие продвинутся дальше и т.д. Таким образом, в хроматографическом процессе сочетаются термодинамический (установление равновесия между фазами) и кинетический (движение компонента с разной скоростью) аспект.

Способы хроматографии.По способу хроматографирования различают колоночную и плоскостную хроматографию. Наиболее широко распространена колоночная.

На колонках существует несколько приёмов разделения вещества. Чаще всего используется элюентная колоночная хроматография. При таком способе хроматографирования в колонку вводится порция смеси, а затем колонку промывают растворителем, который называют элюент. По мере продвижения элюента через колонку вещества продвигаются с различной с ним скоростью, которая зависит от сродства веществ к сорбенту. В результате на выходе из колонки сначала появляется наименее сорбированное вещество, затем другие – в зависимости от силы сорбции. Фиксируя аналитический сигнал на выходе, получают элюентную хроматограмму, которая представляет собой ряд пиков, каждый из которых соответствует отдельным компонентам смеси (рис. 43).

Наиболее широко применяемые виды хроматографии – жидкостная ионообменная, распределительная, высокоэффективная жидкостная (рис. 44, 45) и газовая. Для определения биологической активности почв, активности денитрификации, несимбиотической азотфиксации, скорости эмиссии СО₂ в почве чаще всего используется высокоэффективная газовая хроматография.

Рис. 43. Адсорбционная жидкостная хроматография

Рис. 44. Блок-схема жидкостного хроматографа: 1 – приёмник анализируемого вещества; 2 – насос; 3 – инжектор; 4 – хроматографические колонки; 5 – термостат; 6 – детекторы; 7 – регистрирующая система (дифференциальный усилитель, самописец); 8 – компьютер

Насос 2 (см. рис. 44) предназначен для создания постоянного потока растворителя. Его конструкция определяется, прежде всего, рабочим давлением в системе. Для работы в диапазоне 10-500 МПа используются насосы плунжерного (шприцевого) либо пистонного типов. Недостатком первых является необходимость периодических остановок для заполнения элюентом, а вторых – большая сложность конструкции и, как следствие, высокая цена. Для простых систем с невысокими рабочими давлениями (1-5 МПа) с успехом применяют недорогие перистальтические насосы, но так как при этом трудно добиться постоянства давления и скорости потока, их использование ограничено препаративными задачами.

Инжектор 3 обеспечивает ввод пробы смеси разделяемых компонентов в колонку с достаточно высокой воспроизводимостью. Простые системы ввода пробы – stop-flow требуют остановки насоса и поэтому менее удобны, чем петлевые дозаторы, разработанные фирмой Reodyne.

Колонки 4 для ВЭЖХ представляют собой толстостенные трубки из нержавеющей стали, способные выдержать высокое давление. Большую роль играет плотность и равномерность набивки колонки сорбентом. Для жидкостной хроматографии низкого давления с успехом используют толстостенные стеклянные колонки. Постоянство температуры обеспечивается термостатом 5.

Детекторы 6 для жидкостной хроматографии имеют проточную кювету, в которой происходит непрерывное измерение какого-либо свойства протекающего элюента. Наиболее популярными типами детекторов общего назначения являются рефрактометры, измеряющие показатель преломления, и спектрофотометрические детекторы, определяющие оптическую плотность растворителя на фиксированной длине волны (как правило, в ультрафиолетовой области). К достоинствам рефрактометров (и недостаткам спектрофотометров) следует отнести низкую чувствительность к типу определяемого соединения, которое может и не содержать хромофорных групп. С другой стороны, применение рефрактометров ограничено изократическими системами (с постоянным составом элюента), так что использование градиента растворителей в этом случае невозможно.

Регистрирующая система 7 в простейшем случае состоит из дифференциального усилителя и самописца. Желательно также наличие интегратора, позволяющего рассчитывать относительные площади получаемых пиков. В сложных хроматографических системах используется блок интерфейса, соединяющий хроматограф с персональным компьютером 8, который осуществляет не только сбор и обработку информации, но и управляет прибором.

Для непрерывной регистрации концентрации компонентов, выходящих из колонки, используют специальное устройство – детектор. Для регистрации можно использовать измерение любого аналитического сигнала, идущего от подвижной фазы и связанного с природой и количеством компонентов смеси.

В жидкостной хроматографии используют такие аналитические сигналы, как светопоглощение выходящего раствора (фотометрические детекторы), показатель преломления (рефрактометрические детекторы) и электрическая проводимость (электрохимические детекторы).

Рис. 45. Усовершенствованная серия приборов для жидкостной хроматографии System GOLD Nоuveau (комплектуется из отдельных модулей)

В газовой хроматографии подвижной фазой является инертный газ – азот, гелий, водород. Пробу подают в виде паров. Неподвижной фазой служит либо твёрдое вещество (газотвёрдофазная и газоадсорбционная хроматография), либо жидкость, нанесённая на твёрдый носитель (газожидкостная, газораспределительная). Чаще используют газораспределительную хроматографию. Выходные из колонки компоненты можно детектировать различными способами и получать хроматограммы в виде пиков (рис. 46). В основе количественного анализа лежит зависимость высоты пика (h) и его площади (S) от количества вещества. Для узких пиков предпочтительнее измерение высоты (h), для широких, размытых – площади (S). Раньше площадь пиков вычисляли планиметром. В современных хроматографах имеются специальные устройства (электрический или электронный интегратор), которые автоматически вычисляют площадь пиков. Для определения концентрации обычно используют метод градуировочного графика: строят графики зависимости h (S) от концентрации С для каждого компонента смеси.

В газовой хроматографии применяют детекторы, действие которых основано либо на зависимости аналитического сигнала от концентрации компонента, либо от скорости движения компонента. К первой группе относятся детекторы по теплопроводности и детекторы электронного захвата; ко второй – пламенно-ионизационный и пламенно-фотометрический детекторы.

Преимущество такого подхода заключается в том, что для решения конкретной аналитической задачи выбираются только необходимые модули, а при изменении задачи есть возможность доукомплектовать прибор недостающими модулями.

Рис. 46. Принципиальная схема газового хроматографа: 1 – источник газа-носителя; 2 – вентиль тонкой регулировки скорости потока газа-носителя; 3 – устройство для ввода пробы; 4 – хроматографическая колонка; 5 – детектор; 6 – термостат колонки и термостат детектора; 7 – регистратор; 8 – измеритель скорости потока газа-носителя

В фотометрических детекторах излучение от источника (видимое или ультрафиолетовое) разделяется на два потока. Один из них проходит через кювету, в которую подается элюат. Другой поток проходит через кювету сравнения. Затем оба потока попадают на два фотоэлемента. Для обработки информации к хроматографу подключается компьютер.

Действие пламенно-ионизационного детектора основано на возникновении ионов при сгорании органических соединений газов. Ионы объединяют в направленный пучок и измеряют получившийся ток ионизации. Для сгорания в элюат вводят водород.