Лабораторная диагностика вирусных респираторных инфекций (грипп, прагрипп, корь, эпидемический паратит).

Вирусы — возбудители острых респираторных заболеваний

Возбудителями заболеваний дыхательных путей могут быть различные виды бактерий (в том числе Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus, Klebsiella, Coxiella burnetii, Mycoplasma и др.), а также вирусы. Инфекции, вызываемые вирусами, принято называть острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ). По своей частоте они занимают первое место среди всех заболеваний. Каждый человек в течение жизни неоднократно болеет ОРЗ. Причин этому несколько: большое количество вирусов — возбудителей ОРЗ (более 130); отсутствие пере­крестного иммунитета между ними; отсутствие против многих из них эффективных вакцин; наипро­стейший способ заражения (воздушно-капельным путем), обусловливающий быстрое распростране­ние возбудителя, которое при отсутствии иммунитета может стать причиной не только эпидемий, но и пандемий.

Возбудителями ОРЗ являются следующие вирусы;

1. Вирусы гриппа А, В, С (Orthomyxoviridae).

2. Парамиксовирусы (Paramyxovirldae) — это семейство включает три рода; Paramyxovirus — вирусы парагриппа человека (ВПГЧ) 1, 2, 3, 4-го типов, болезни Ньюкасл, парагриппа птиц и паротита; Pneumovirus — респираторно-синцитиальный вирус (RS-вирус); Morbillivirus — вирус кори.

3.Респираторные коронавирусы (Coronaviridae).

4.Респираторные реовирусы (Reoviridae).

5.Пикорнавирусы (Picornaviridae). Из этого семейства собственно возбудителями ОРЗ являются риновирусы (Rhinovirus, более 100 серовариантов), а также некоторые сероварианты вирусов Коксаки и ECHO (Enterovirus).

Все перечисленные пять семейств относятся к РНК-содержащим вирусам.

6. Респираторные аденовирусы (Adenoviridae), их геном представлен ДНК.

Таким образом, возбудителями ОРЗ являются 5 семейств РНК-содержащих и 1 семейство ДНК-содержащих вирусов. Возникает вопрос: почему столь большое количество разнообразных вирусов может поражать эпителиальные клетки слизистой оболочки дыхательных путей (главным образом верхних) и глаза? Ответ на этот вопрос может быть однозначным: мембраны этих клеток несут множество разнообразных рецепторов, с которыми взаимодействуют разнообразные рецепторы вирусов. Только после специфической адсорбции на клетке вирус может в нее проникнуть и вызвать заболевание.

По частоте, с которой они вызывают ОРЗ, вирусы можно расположить в следующей последова­тельности в порядке убывания: риновирусы, коронавирусы, RS-вирус, вирусы парагриппа, аденовиру­сы, вирус гриппа. Однако по масштабу вызываемых вспышек и по тому ущербу, который они наносят здоровью человека и экономике, главную роль играют вирусы гриппа.

Вирусы гриппа

Вирус гриппа А вызвал крупнейшие пандемии в 1889, 1918 («испанка»), 1957, 1968, 1977 гг. Название болезни «грипп» было дано в XVIII в. французским врачом Ф. Бруссе (от фр. gripper — схватить). В Италии эта болезнь получила название «инфлюэнца» (итал. influenza di freddo — влияние холода). Грипп вызывают три вируса: А (открыт в 1933 г. В. Смитом, С. Эндрюсом и П. Лейдлоу), В (открыт в 1940 г. Т. Френсисом) и С (открыт в 1947 г. Р. Тэйлором).

Отличаются типы вируса А, В и С по нуклеопротеидным антигенам.

Вирус типа А вызывает грипп у человека, млекопитающих животных и птиц, а вирусы типа В и типа С — только у человека.

Наибольшую роль в эпидемиологии гриппа играет вирус типа А, он вызывал все пандемии, что связано с особой изменчивостью его антигенной структуры. Начиная с 1957 г., эпидемии гриппа происходят ежегодно.

Вирус гриппа А

Вирион имеет сферическую форму и диаметр 80-120 нм, его молекулярная масса 250 МД. Геном вируса представлен однонитевой фрагментированной (8 фрагментов) негативной РНК с общей м.м. 5 МД. Тип симметрии нуклеокапсида спиральный. Вирион имеет суперкапсид (мембрану), содержа­щий два гликопротеида — гемагглютинин и нейраминидазу, которые выступают над мембраной в виде различных шипов.

Гемагглютинин имеет структуру тримера с м.м. 225 кД; м.м. каждого мономера 75 кД. Мономер состоит из меньшей субъединицы с м.м. 25 кД (НА2) и большей — с м.м. 50 кД (НА1). Основные функции гемагглютинина:

1) распознает клеточный рецептор — мукопептид, имеющий N-ацетилнейраминовую (сиаловую) кислоту;

2) обеспечивает слияние мембраны вириона с мембраной клетки и мембранами ее лизосом, т. е. отвечает за проникновение вириона в клетку;

3) определяет пандемичность вируса (смена гемагглютинина — причина пандемий, его изменчи­вость — эпидемий гриппа);

4) обладает наибольшими протективными свойствами, отвечая за формирование иммунитета.

Устойчивость вируса во внешней среде.Вирус гриппа чувствителен к нагреванию (при 65 °С погибает в течение 5-10 мин), высушиванию, действию солнечных лучей, УФ-свету; при комнатной температуре погибает за несколько часов. Легко обезвреживается дезинфицирующими веществами, разрушается эфиром, который растворяет его липидную оболочку, а также кислой и щелочной средой.

Эпидемиология.Источник инфекции — только человек, больной или носитель (у некоторых людей грипп протекает в стертой или даже скрытой форме). Заражение происходит воздушно-капель­ным путем. В связи с тем, что инкубационный период очень короток, возникшая эпидемия распрост­раняется очень быстро и при отсутствии коллективного иммунитета может перерасти в пандемию. Основным регулятором эпидемий гриппа является иммунитет. По мере нарастания иммунной про­слойки к вирусу эпидемия гриппа идет на убыль. Но, вместе с тем, в результате формирования иммунитета происходит селективный отбор штаммов вируса с измененной антигенной структурой, прежде всего гемагглютинина и, в меньшей степени, нейраминидазы, которые продолжают вызывать вспышки до тех пор, пока и к ним не появятся антитела. Такой антигенный дрейф и поддерживает непрерывность эпидемий. Однако у вируса гриппа А обнаружена еще одна форма изменчивости, получившая название шифта, или сдвига, связанная с полной сменой одного типа гемагглютинина (а реже и нейраминидазы) на другой.

Все пандемии гриппа были вызваны вирусами гриппа А, претерпевшими шифт. Пандемия гриппа 1918 г. была вызвана вирусом с фенотипом H1N1 (погибло около 20 млн человек); пандемия 1957 г. — вирусом H2N2 (переболело более половины населения мира); 1968 г. — вирусом H3N2. Для объясне­ния причин такой резкой смены типов вирусов гриппа А были предложены две гипотезы. Согласно одной из них, вирус, вызвавший пандемию, после возникновения к нему иммунитета переходит на популяции млекопитающих или птиц. Затем в результате генетических рекомбинаций (чему способ­ствует фрагментированный геном) между вирусами А человека и животных возникает рекомбинантный штамм с новым типом гемагглютинина, к которому у людей еще нет иммунитета, и он вызывает новую пандемию гриппа. Согласно другой, антропонозной гипотезе, выдвинутой А. А. Смородинцевым, вирус, исчерпавший свои эпидемические возможности, не исчезает, а продолжает циркулировать в коллективе без заметных вспышек или длительно персистировать в организме человека. Через 10-20 лет, когда появится новое поколение людей, не имеющих к нему иммунитета, этот вирус возвращается и становит­ся причиной новой пандемии.

В пользу этой гипотезы говорит тот факт, что вирус гриппа А с фенотипом H1N1, исчезнувший в 1957 г., когда его вытеснил вирус H2N2, вновь появился, после двадцатилетнего отсутствия, в 1977 г. Кроме того, по данным серологической археологии, пандемия 1889 г. была, очевидно, вызвана вирусом с фенотипом H2N2, так как в 1957 г. антитела к нему были обнаружены только у людей старше 70 лет, не болевших во время пандемии 1957 г. Наконец, установлено, что грипп у людей вызывали и вызывают вирусы типа А только трех или четырех фенотипов, а именно; H1N1 (H0N1); H2N2; H3N2. Вместе с тем выявилась новая эпидемиологическая особенность гриппа: если раньше каждый новый пандемический вариант полностью вытеснял своего предшественника, то с 1977 г. вирусы с фенотипами H1N1 и H3N2 как бы сосуществуют в коллективе, обладая, вероятно, до определенного времени равными эпидемическими возможностями.

Антигенные дрейфы и шифты вируса гриппа являются главным препятствием на пути к созданию эффективных вакцин.

Особенности патогенеза и клиники.Инкубационный период при гриппе короткий — 1-2 сут. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки дыхательных путей с преимуще­ственной локализацией в области трахеи, что клинически проявляется в виде сухого мучительного кашля с болями по ходу трахеи. Продукты распада пораженных клеток попадают в кровь, вызывают сильную интоксикацию и повышение температуры тела до 38-39 °С. Повышение проницаемости сосудов, обусловленное повреждением клеток эндотелия, может стать причиной патологических изме­нений в различных органах: точечных кровоизлияний в трахее, бронхах, а иногда и отека мозга с летальным исходом. Вирус гриппа оказывает угнетающее действие на кроветворение и иммунную систему. Все это может приводить к вторичным вирусным и бактериальным инфекциям, которые осложняют течение болезни.

Постинфекционный иммунитет.Прежние представления о том, что после перенесенного грип­па остается слабый и кратковременный иммунитет, опровергнуты после возвращения вируса H1N1 в 1977 г. Этот вирус вызывал заболевание главным образом у людей не старше 20 лет, т. е. у тех, кто не болел им раньше, до 1957 г. Следовательно, постинфекционный иммунитет достаточно напряжен­ный и продолжительный, но носит выраженный типоспецифический характер.

Главная роль в формировании приобретенного иммунитета принадлежит вируснейтрализующим ан­тителам, блокирующим гемагглютинин и нейраминидазу, а также секреторным иммуноглобулинам IgAs.

Лабораторная диагностика.Материалом для исследования служит отделяемое носоглотки, которое получают либо путем смыва, либо с помощью ватно-марлевых тампонов, и кровь. Методы диагностики:

1. Вирусологический — заражение 10-11-дневных куриных эмбрионов, реже — культур клеток эмбриона человека. Вирус идентифицируют с помощью РТГА.

2. Серологический — выявление специфических антител и возрастания их титра (в парных сыворотках) с помощью РТГА, РСК, иммуноферментного метода.

3. В качестве ускоренной диагностики используют иммунофлуоресцентный метод, позволяющий быстро обнаружить вирусный антиген в мазках-отпечатках со слизистой оболочки носа или в смывах из носоглотки больных.

4. Разработаны методы иммуноферментного анализа для выявления вирусных антигенов непосред­ственно в материале от больных, а также метод РНК-зонда.

5. Предложена иммуноферментная методика «бескровного» обнаружения специфических секретор­ных IgAs в слюне в качестве самостоятельного способа диагностики гриппа.

Лечение.Рекомендуются химиопрепараты: амантадин и ремантадин (действуют только на вирус гриппа А), противогриппозный иммуноглобулин, интерферон. Лечение следует начинать как можно раньше.

Специфическая профилактика.Ежегодно в мире гриппом болеют сотни миллионов людей, что наносит колоссальный ущерб здоровью населения и экономике каждой страны. Единственным надеж­ным средством борьбы с ним является создание коллективного иммунитета. Для этой цели предложе­ны и используются следующие типы вакцин:

1) живая из аттенуированного вируса;

2) убитая цельновирионная;

3) субвирионная вакцина (из расщепленных вирионов);

4) субъединичная — вакцина, содержащая только гемагглютинин и нейраминидазу.

Детей от 6 мес до 12 лет, по рекомендации ВОЗ, следует прививать только субъединичной вакциной как наименее реактогенной и токсичной. Главная проблема в повышении эффективности противогриппозных вакцин — обеспечение их специфичности против актуального вируса, т. е. того варианта вируса, который вызвал данную эпидемию. Иначе говоря, вакцина должна содержать специфические антигены актуального вируса. Основным путем повышения качества вакцины является поиск тех эпитопов вирусов гриппа, которые являются наиболее консервативными, а стало быть, общими для всех его антигенных вариантов, и придают им высокую иммуногенность. По этому пути ведутся поиски высокоэффективных искусствен­ных вакцин против гриппа.

Вирус гриппа В

Структура вириона сходна со структурой вируса А. Геном состоит из 8 фрагментов, кодирующих 3 неструктурных и 7 структурных белков. По антигенным свойствам гемагглютинина и нейраминидазы различают несколько серовариантов. Процесс антигенного дрейфа выражен слабее, чем у вируса А. Вирусы гриппа типа В являются виновниками локальных вспышек и эпидемий; пандемий не вызывают. Клиника заболевания такая же, как и при гриппе типа А. Лабораторная диагностика такая же, вирус дифференцируется серологически. Специфическая профилактика осуществляется так же, как против гриппа А.

Вирус гриппа С

Вирион имеет такую же форму, как вирусы типов А и В. Однако он отличается от них не только антигенными свойствами, но и по ряду других признаков. Геном представлен однонитевой негативной РНК из 7 фрагментов, нуклеотидная последовательность которых существенно отличается от таковых вирусов типов А и В. Геном кодирует 1-2 неструктурных и 6 структурных белков. У вируса типа С отсутствует нейраминидаза, поэтому на наружной мембране вириона имеется только один тип шипов, имеющих такие же размеры, как и у вирусов типов А и В (высота 8-10 нм, диаметр 4-5 нм), но расположенных, в отличие от вирусов А и В, не беспорядочно, а с четкой гексагональной ориентаци­ей на расстоянии 7,5 нм друг от друга. Вирусу типа С не свойственна такая изменчивость, как вирусу типа А. Хотя вирус гриппа С не вызывает пандемий и больших эпидемий, он часто является причиной спорадических заболеваний гриппом. Клиника заболе­вания такая же, как при относительно умеренных формах гриппа А. Диагностика основана на выделении вируса в куриных эмбрионах; применяются также иммунофлуоресцентный метод и другие серологические реакции.

Парамиксовирусы

Вирусы парагриппа человека (ВПГЧ) впервые выделены в 1956—1958 гг. в США из носоглотки у детей, больных гриппоподобными заболеваниями, в связи с чем и получили такое название. Вирионы имеют сферическую форму, их диаметр 150-200 нм. Вирусы парагриппа обладают гемагглютинирующей, нейраминидазной, гемолитической и симпластообразующей активностью, одна­ко у разных типов вирусов они проявляются в разной степени.

Особенностью размножения вирусов парагриппа, как и всех парамиксовирусов, является то, что, в отличие от вирусов гриппа, они не нуждаются для своей транскрипции в затравочной мРНК и поэтому не проникают в ядро клетки. Их жизненный цикл, подобно вирусу леса Семлики, протекает в цитоплазме клетки. ВПГЧ плохо размножаются в куриных эмбрионах. Для их выделения применяют культуры клеток, в основном первично-трипсинизированных, при размножении в которых они легко могут быть обнаружены с помощью реакции гемадсорбции. Парамиксовирусы не имеют общего антигена, единого для всего семейства. ВПГЧ по поверхностным антигенам разделены на четыре сероварианта, но их внутренние белки имеют общие детерминанты.

Вирусы парагриппа — очень распространенные возбудители ОРЗ. У взрослых эти заболевания протекают легче, чем грипп. При этом ВПГЧ чаще поражают клетки гортани, поэтому заболевание протекает с явлениями ларингита (сухой болезненный кашель, охрипший голос). У детей заболева­ния, вызываемые ВПГЧ, протекают более тяжело, у них чаще развивается интоксикация. Наиболее тяжело протекают заболевания, вызываемые ВПГЧ-3, особенно у детей первого года жизни. ВПГЧ-3 являются виновником 60-70% заболеваний нижних отделов дыхательных путей (бронхиолиты, пнев­монии) у детей первых полутора лет жизни. Для заболеваний, вызываемых вирусами парагриппа 1-го и 2-го типов, характерен симптом ложного крупа.

Вирусы парагриппа вызывают в основном локальные вспышки, однако они наблюдаются повсемест­но, особенно в странах с умеренным климатом.

Для лабораторной диагностикипарагриппозных заболеваний применяются следующие методы:

а) обнаружение вирусных антигенов с помощью методов иммунофлуоресценции и ИФМ в эпители­альных клетках слизистой оболочки носовых ходов и носоглотки;

б) выделение вируса в культурах клеток с последующей идентификацией его с помощью реакций торможения гемадсорбции или гемагглютинации;

в) определение противовирусных антител с помощью реакций торможения гемадсорбции (гемагглютинации) или нейтрализации в культуре клеток с использованием парных сывороток (нарастание
титра антител).

Методы специфической профилактики не разработаны.