Микробиологичеакая диагностика гонококковых и менингококковых инфекций.

Менингококки.

Менингококки относятся к роду Neisseria, род N. meningitidis.

Это диплококки бобовидной формы, в мазках имеют вид ко­фейных зерен. Спор не образуют, жгутиков не имеют, в организ­ме образуют капсулу. Грамотрицательные. Строгие аэробы.

Менингококки требовательны к питательным средам — растут только на средах, содержащих человеческий белок (сыво­роточный агар, асцитагар), при температуре 37 °С. На сывороточном агаре образуют нежные прозрачные колонии средней величины. В сывороточном бульоне дают рост в виде помутнения и осадка на дне.

Биохимически малоактивны, ферментируют только глюкозу и мальтозу, образуя кислоту, но не образуя газ. Крайне неустой­чивы во внешней среде, чувствительны к перемене температуры, погибают при температуре ниже 37 °С.

По капсульному полисахаридному антигену менингококки под­разделяют на четыре основные серогруппы (группы А, В, С, D) и три дополнительные (X, Y, Z).

Клинические формы могут быть различными: менингококковый назофарингит, цереброспинальный менингит, менингококкцемия (менингококковый сепсис), менингококковый эндокардит и др.

После перенесенного заболевания формируется стойкий видоспецифический антимикробный иммунитет. У детей младшего возраста имеется пассивный иммунитет, обусловленный получен­ными от матери IgG.

Диагностика:

1) бактериологическое исследование; материал для исследова­ния определяется клинической формой заболевания; среда —
сывороточный агар;

2) иммуноиндикация: иммунофлюоресценция, ИФА, реакции
преципитации, латексагглютинации;

3) серодиагностика: РПГА с парными сыворотками (для диаг­ностики генерализованных форм инфекции). Лечение: этиотропная терапия: сульфаниламиды, пенициллины, хлорамфеникол.

Специфическая профилактика:

химическая менингококковая вакцина, содержащая поли
сахаридные антигены серогрупп А и С (активный антимикроб­ный иммунитет);

человеческий иммуноглобулин (пассивный антимикроб­ный иммунитет).

Менингококковую инфекцию вызывают менингококки — Neisseria meningitidis (бактерии 3й группы патогенности). Материалом для исследования служит отделяемое носоглотки, спинномозго­вая жидкость, кровь, соскоб из элементов геморрагической сыпи на коже, секционный материал.

Менингококки очень чувствительны к колебаниям температу­ры, поэтому материал сразу же сеют на питательные среды или немедленно, не допуская охлаждения, отправляют в лаборато­рию, где до посева сохраняют в термостате.

Отделяемое слизистой оболочки носовой части глотки снима­ют специальным клювовидным (изогнутым под углом) тампоном. Наиболее результативным является немедленный посев носогло­точной слизи на плотные питательные среды с тщательным ра­зобщением бактериальных клеток. Если время доставки в лабора­торию превышает 3 ч., то тампон помещают в пробирку с 3 мл среды обогащения (содержит 0,1 % агарагара, 20% сыворотки и 20 ЕД/мл ристомицина) и ставят в термостат при 37 °С (после подращивания материал высевают на сывороточный агар).

Микроскопия. Микроскопическое исследование спинномозго­вой жидкости и крови дает возможность определить наличие воз­будителя. Если спинномозговая жидкость имеет вид гноя, то маз­ки готовят без ее предварительной обработки; при незначитель­ной мутности спинномозговую жидкость центрифугируют и из осадка делают мазки. Окрашивают их по Граму, водным раство­ром основного фуксина и/или метиленовым синим. При окраске по Граму форменные элементы спинномозговой жидкости могут изменяться, что осложняет обнаружение возбудителя. Менинго­кокки имеют вид диплококков бобовидной формы, соприкасающихся вогнутыми краями и расположенных внутри цитоплазмы лейкоцитов. Часто обнаруживается нежная капсула. При менингококцемии менингококки иногда можно обнаружить в мазках кро­ви. Для этого готовят препарат толстой капли и без фиксации окра­шивают его 2 — 3 мин водным раствором метиленовой сини, лиш­нюю окраску смывают водопроводной водой и высушивают пре, парат на воздухе. На голубом фоне препарата видны окрашенные в темносиний цвет лейкоциты, а между ними множество мелких, темносиних кокков, расположенных в виде кучек, парно или по одному.

Экспресс-диагностика основана на обнаружении в спинномозговой жидкости или крови больного специфического антигена, Осуществляется с помощью латексагглютинации, ИФА, встречного иммуноэлектрофореза с групповыми преципитирующими сыворотками. Эти методы приобретают особое значение при неэффективности микроскопической диагностики и посевов.

Бактериологическое исследование. Менингококк растет на питательных средах с нативным белком (бульон или агар сывороткой, асцитической жидкостью или кровью). Для исследования материала, обильно контаминированного нормофлорой мазки из носоглотки), применяют посев на плотные селективыс среды с антибиотиками (ристомицином, ванкомицином и нистатином). Спинномозговую жидкость лучше сеять после центрифугирования (3000 об/мин в течение 5 мин). Засевают 2 — 3 капли полученного осадка на поверхность подогретой питательной среды в чашке и инкубируют при 37 "С в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (используют СО₂инкубатор, газогенераторные пакеты или эксикатор с зажженной свечой). Ос­таток спинномозговой жидкости используют для РВИЭФ и дру­гих методов индикации возбудителя. Как правило, одновременно с прямым посевом материал засевают на среду обогащения (на­пример, полужидкую сывороточную среду) с последующим пе­ресевом на плотные среды для выделения чистой культуры.

На 2 —3й день инкубации менингококки образуют мелкие, круглые, выпуклые, прозрачные колонии. В мазках, приготовлен­ных из этих колоний, обнаруживают полиморфные диплококки и тетракокки (картина настолько пестрая, что создается впечатле­ние смешанной культуры). Колонии пересевают на скошенный сывороточный агар. Если в «прямых» посевах материала рост от­сутствует, культуру выделяют из спинномозговой жидкости, за­литой полужидким агаром (со среды обогащения).

На 3й день исследования для идентификации чистой культу­ры у нее выявляют оксидазную активность и делают посев на сре­ды с углеводами. Менингококки обладают оксидазой, ферментируют глюкозу и мальтозу с образованием кислоты, лак­тозу, сахарозу и фруктозу не ферментируют, полисахарид из са­харозы не образуют, не растут в присутствии 0,2% желчи. Для выявления оксидазной активности на кусочек фильтровальной бумаги, смоченной каплей свежеприготовленного 1%го раствора солянокислого парадиэтилфенилендиамина, петлей наносят куль­туру менингококков. Культуры, обладающие оксидазной актив­ностью, в течение 30 — 60 с вызывают вначале порозовение, а затем почернение бумаги с реактивом. Для определения способ­ности образовывать полисахарид культуры нейссерий засевают на бескрахмальную среду с 1 % сахарозы и инкубируют при 37 °С в течение 24 — 48 ч, после чего на рост наносят каплю йодного ра­створа Люголя. В случае образования полисахарида сразу развива­ется буро-лиловое окрашивание.

Для дифференциации менингококка и непатогенных нейссе­рий (Neisseria mucosa, Neisseria sicca и др.) используют свойство пос­ледних расти на простых питательных средах, а также способность образовывать колонии при комнатной температуре (22 °С).

Для обнаружения менингококка в крови во флаконы с 50 мл бульона, содержащего 0,1 % агарагара, засевают 5 —10 мл кро­ви, асептически взятой из вены. Через сутки делают пересев куль­туры на сывороточный агар. Выделение и идентификация культур осуществляются таким же образом, как и при исследовании спин­номозговой жидкости.

Серологическое исследование.Серодиагностику применяют в качестве вспомогательного метода (в основном для эпидемиоло­гического анализа). Ставят РНГА с эритроцитами, нагруженными группоспецифическими полисахаридными АГ или ИФА с теми же антигенами.

Рис. Колонии менингококков.

Гонококки

Относятся к роду Neisseria, вид N. gonorrhoeas.

Это диплококки бобовидной формы, в мазках располагаются внутриклеточно в протоплазме лейкоцитов, имеют вид кофейных зерен.

Спор не образуют, неподвижны, образуют микрокапсулу, грамотрицательные. Являются облигатными аэробами.

Гонококки исключительно требовательны к питательным сре­дам, растут только на средах, содержащих человеческие белки (сывороточном агаре, асцитагаре и др.). На сывороточном агаре образуют мелкие блестящие колонии в виде капель.

1)Биохимически малоактивны, расщепляют только глюкозу (до кислоты).

Гонококковая инфекция— антропонозная инфекция, источник заражения — больной человек, носительства не бывает. Путь передачи половой, возможно заражение новорожденного при прохождении через родовые пути больной матери.

Клинические формы гонококковой инфекции:

1) гонорея (урогенитальная, экстрагенитальная);

2) гонококковая септикопиемия;

3) специфический конъюнктивит новорожденных (возникает
только при прохождении через родовые пути больной гоно­реей матери).

По длительности течения гонореи и выраженности клинических признаков различают:

1) свежую гонорею (длительность течения не более 2 месяцев):

а) острую;

б) подострую;

в) торпидную;

2) хроническую гонорею (вялотекущее заболевание продолжительностью более 2 месяцев или с неустановленным сроком).
По клиническому течению различают:

1) неосложненную гонорею (гнойное воспаление нижних отделов урогенитального тракта);

2) осложненную гонорею (процесс распространяется на верх­ние отделы мочеполовой системы).

Перенесенное заболевание не оставляет стойкого иммунитета. Диагностика:

1) при острой форме:

а) бактериоскопия мазка отделяемого уретры, шейки матки;

б) бактериологическое исследование;

2) при хронической форме:

а) бактериоскопия;

б) бактериологическое исследование;

в) серодиагностика — РСК;

г) иммуноиндикация.

Особенность серодиагностики: диагноз ставится качественно по обнаружению в сыворотке обследуемого антител) по резуль­татам однократной реакции (без парных сывороток). Это объяс­няется тем, что постинфекционный иммунитет при гонорее не формируется (нет постинфекционных антител).

Лечение: этиотропная терапия антибиотиками.

Специфическая профилактика не разработана.

Микроскопия.Готовят не менее двух мазков на предметном стекле. Мазки фиксируют в фиксирующей жидкости и окрашивают щелочным раствором метиленового синего и по Граму. При микроскопии гонококки имеют вид бобовидных грамотрицательных диплокок­ков, расположенных, подобно менингококкам, внутри клеток (нейтрофильных гранулоцитов), а также внеклеточно. Окраска по Граму позволяет дифференцировать гоно­кокки со стафилококками и другими бактериями.

При хронической гонорее в мазках обнаруживается большое количество сопутствующих микроорганизмов, а морфология воз­будителя может меняться: наблюдаются диплококки с неодина­ковыми по величине и форме клетками. При неадекватном лече­нии сульфаниламидами и антибиотиками происходят значитель­ные изменения формы и величины гонококков: крупные шаро­видные, величиной до размеров эритроцита, либо мелкие пыле­видные — Lформы.

В связи с тем, что в исследуемом материале могут находиться и другие грамотрицательные бактерии, сходные с гонококками, применяют методы индикации. Так, мазки обрабатывают флюоресцирующими антителами против гонококков и при люминес­центной микроскопии наблюдают свечение клеток гонококков (прямая РИФ). Бактериоскопическое исследование, особенно при хронической, леченой гонорее, а также гонорее у женщин не все­гда дает положительный результат, поэтому используют другие методы диагностики.

Бактериологическое исследование.Его проводят в тех случаях, когда гонококки в мазках не обнаруживают или находят нетипич­ные, измененные формы. Культуральное исследование необходи­мо для контроля излеченности, при диагностике заболевания у детей, для судебномедицинской экспертизы. Ввиду особой чув­ствительности гонококка к охлаждению материал для исследова­ния по возможности не транспортируют. Кроме того, гонококк очень чувствителен ко многим антимикробным веществам, по­этому за 1 —2 дня до посева необходимо исключить применение больным антисептиков и прекратить антибактериальную терапию.

При хронической гонорее перед исследованием для повыше­ния вероятности выявления возбудителя проводят провокацию биологическим методом: однократное внутримышечное введение гоновакцины взрослым в количестве 500 млн микробных тел, де­тям старше 3х лет — 100 — 200 млн микробных тел, детям старше 3х лет — 100 — 200 млн микробных тел. Детям до 3х лет гоновакцину не вводят. Провокация может быть также термической, ме­ханической и алиментарной.

Посев производят непосредственно после взятия материала.

Для культивирования гонококка используют МПА (рН 7,4) с добавлением асцитической жидкости — асцитагар.

Применяются также среды следующего состава, мл:

Среда № 1

МПА из кроличьего мяса

или бычьих сердец, рН 7,4 — 7,5...... 100

Гидролизат казеина............................ 2

Дрожжевой аутолизат......................... 2

Сыворотка крови крупного рогатого скота 20

Среда № 2

МПА из кроличьего мяса, рН 7,4...... 100

Гемогидролизат.................................. 2

Дрожжевой аутолизат......................... 2

Сыворотка крови крупного рогатого скота 20

Среда № 3

МПА из кроличьего мяса, рН 7,4...... 100

Среда 199.............................................. 20

Дрожжевой аутолизат............................ 2

Сыворотка крови крупного рогатого скота 20

Среда № 4

МПА из кроличьего мяса, рН 7,4....... 100

Куриный желток.................................. 10

Сыворотка крови крупного рогатого скота 20

Для подавления роста сопутствующей микрофлоры в среду ре­комендуется добавить антибиотики: полимиксин М (25 ЕД/мл среды), ристомицина сульфат (20 ЕД/мл среды).

Если нет возможности начать бактериологическое исследова­ние на месте, для сохранения жизнеспособности гонококков ма­териал после взятия помещают в транспортные среды, хранят при 4— 15 "С не более 24 ч, а затем пересевают на вышеуказанные среды.

Посевы культивируют при 37 °С в атмосфере с 10 % СО₂. Гоно­кокк дает рост обычно через 24 ч в виде мелких колоний, напоми­нающих росу, бесцветных или слегка желтоватых. Края колонии ровные, поверхность блестящая и гладкая. Характерным призна­ком является ранний аутолиз центральной части колоний.

Выделенные чистые культуры идентифицируют по морфоло­гическим, тинкториальным и биохимическим свойствам. Основ­ные дифференциально-диагностические свойства гонококков пред­ставлены выше. У выделенных культур обязательно проверяют чувствительность к антимикробным препаратам, в пер­вую очередь пенициллинам.

Серологическое исследование.Серодиагностику проводят при хронической гонорее, когда у больного отсутствуют выделения и провести бактериоскопическое или бактериологическое исследо­вание не представляется возможным. В этих случаях сыворотку крови больного исследуют в РСК или РНГА со стандартным гонококко­вым антигеном.

ПЦР.В настоящее время разработаны тестсистемы для ПЦРдиагностики гонококковой инфекции, по чувствительности и специфичности превосходящие культуральный метод, в том чис­ле при использовании проб, взятых неинвазивными методами (например, мочи). При этом имеется возможность выявления ге­нов антибиотикоустойчивости у штаммов N. gonorrhoeae. Широко внедряется в практику комбинированный тест (мультиплексная ПЦР) для выявления Neisseria gonorrhoeae, Chlamidia trachomatis и Trichomonas vaginalis.

СИТУАЦИОННЫЕ ЗАДАЧИ:

1. Объясните происхождение зон гемолиза. Как отличить пневмококки – β гемолитические –от α –гемолитических?

2. Перечислите возможные методы лабораторной диагностики при гонококковой инфекции.

3. Назовите основные факторы патогенности менингококка.

4. Кто является основным источником менингококковой инфекции?

5. Перечислите факторы патогенности для менингококка.