МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ – МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЛОСТИ РТА
Кафедра микробиологии.
МИКРОБИОЛОГИЯ, ВИРУСОЛОГИЯ – МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЛОСТИ РТА
Часть 1
Учебное пособие
Владикавказ, 2012 г.
СОСТАВИТЕЛИ:
Л.Я. Плахтий –д.м.н., профессор, зав.кафедрой микробиологии ГОУ ВПО СОГМА Росздрава.
А.Ч. Цховребов –к.м.н., ассистент кафедры микробиологии ГОУ ВПО СОГМА Росздрава.
РЕЦЕНЗЕНТЫ:
В.Н. Царев –д.м.н., профессор, зав.кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии МГМСУ.
С.В. Сирак –д.м.н., профессор, зав.кафедрой стоматологии ФПО СтГМА.
Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности высшего профессионального образования Стоматология. Учебно пособие написано в соответствии с программой для студентов медицинских вузов, предназначено для изучения микробиологии, вирусологии – микробиологии полости рта на стоматологическом факультете. Пособие соответствует требованиям ФГОС и примерной программе по дисциплине (2011 г.). Пособие (часть 1 и часть 2) содержит основные разделы программного материала общей и специальной микробиологии, вирусологии и микробиологии полости рта, дано подробное практическое руководство для лабораторных занятий. Пособие дополнено таблицами, схемами, внеаудиторной самостоятельной работой, тестовыми заданиями и представляется необходимым в связи с отсутствием литературы для стоматологического факультета.
Химический состав клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных прокариот
| Компоненты клеточной стенки | Грамположительные прокариоты | Грамотрицательные прокариоты | |
| Внутренний слой (пептидогли-кановый) | Внешний слой (наружная клеточная мембрана) | ||
| Пептидогликан | + | + | - |
| Тейхоевые кислоты | + | - | - |
| Полисахариды | + | - | + |
| Белки | ± | - | + |
| Липиды | ± | - | + |
| Липополисахариды | - | - | + |
| Липопротеиды | - | ± | + |
Тейхоевые кислоты (полифосфатные соединения) делят на 2 класса:
1) стеночные, связанные с пептидогликаном клеточной стенки;
2) мембранные (липотейхоевые), соединенные с гликолипидом цитоплазматической мембраны.
ТК могут связываться с клеточными мембранами животных клеток и осуществлять процесс адгезии, необходимый для бактериальной колонизации, являющейся первой стадией большинства инфекций. Особый интерес представляет изучение явления индукции тейхоевыми кислотами воспалительных процессов, цитотоксичности и иммуносупрессии.
На поверхности клеточной стенки грамположительных бактерий могут присутствовать белковые молекулы, не образующие структур определенной формы (белок А стафилококков, М-протеин стрептококков). Они обладают высокой биологической активностью, вызывают агглютинацию эритроцитов, являются иммунодепрессантами, угнетают фагоцитоз, комплемент, препятствуют трансформации лимфоцитов, способствуют адгезии бактерий на клетках эпителия слизистых оболочек. Грамотрицательные прокариоты имеют наружную мембрану, в состав которой входят липиды (22%), белки, полисахариды, липопротеиды. Липополисахариды (ЛПС) - гетерополимеры с комплексной структурой, обладающие разнообразной биологической активностью. Липоидный комплекс обуславливает токсичность (воспалительные реакции, лихорадка, эндотоксиновый шок), полисахаридный компонент ответственен за О-антигенспецифичность. ЛПС индуцирует синтез Jg М-антител, в иммунологии используется в качестве адъюванта и поликлонального активатора В-клеток. Клеточная стенка у бактерий выполняет, в основном, формообразующую и защитную функции, обеспечивает ригидность, формирует капсулу, определяет способность клеток к адсорбции фагов.
Методика окраски по Граму
На мазок кладут фильтровальную бумагу и наливают карболовый раствор генцианового фиолетового на 1-2 мин.
Снимают бумагу, сливают краситель и, не промывая мазок водой, наливают раствор Люголя на 1 мин.
Сливают раствор Люголя и обесцвечивают препарат в 96 0 спирте в течение 30 сек.
Промывают водой.
На фиксированный мазок помещают фильтровальную бумагу и наливают карболовый фуксин Циля и осторожно нагревают на горелке до появления паров. Операцию повторяют 2-3 раза.
Когда препарат остынет, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и промывают препарат водой.
3. Препарат погружают 2-3 раза в стакан с 5% серной кислотой на 1-2 сек.
Тщательно промывают препарат водой и докрашивают щелочным метиленовым синим 3-5 мин.
ЦИТОПЛАЗМА.
Содержимое клетки, окруженное ЦПМ, составляет цитоплазму бактерий. Та часть цитоплазмы, которая имеет гомогенную коллоидную консистенцию и содержит растворимые РНК, ферменты, субстраты и продукты обмена веществ, обозначается как цитозоль. Другая часть цитоплазмы представлена различными структурными элементами: мезосомами, рибосомами, включениями, нуклеоидом, плазмидами.Рибосомы - субмикроскопические рибонуклеопротеидные гранулы диаметром 15-20 нм. В рибосомах находится примерно 80-85% всей бактериальной РНК. Рибосомы прокариот имеют константу седиментации 70 S. Они построены из двух частиц: 30 S (малая субъединица) и 50 S (большая субъединица).
Рис. Рибосома (а) и ее субчастицы -большая (б) и малая (в) (Блинов Н.П., 1989).
Рибосомы служат местом синтеза белка.Некоторые бактерии способны накапливать фосфорную кислоту в виде гранул полифосфата (зерна волютина, метахроматические зерна, зерна Бабеша-Эрнста). Они играют роль фосфатных депо и регулярно выявляются у коринебактерий, микобактерий и спирилл в виде плотных, хорошо контурированных образований в форме шара или эллипса, располагающихся, в основном, у полюсов клетки. Обычно на полюсах бывает по одной грануле.Наличие зерен волютина у бактерий определяют методом Нейссера.
Метод окраски по Нейссеру.
НУКЛЕОИД.
Нуклеоид - ядерный аппарат бактерий. Представлен молекулой ДНК, соответствующей одной хромосоме. Она циркулярно замкнута, располагается в ядерной вакуоле, не имеет ограничивающей от цитоплазмы мембраны и митотического аппарата. С ДНК связано небольшое количество РНК и РНК-полимеразы. ДНК свернуто вокруг центрального стержня, состоящего из РНК и представляет собой высокоупорядоченную компактную структуру. Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пределах 1-3х10 9 , константу седиментации 1300-2000 S. Молекула ДНК включает 1,6х10 7 нуклеотидных пар. Различия в генетическом аппарате прокариотных и эукариотных клеток обуславливает его название: у первых - нуклеоид (образование подобное ядру), в отличие от ядра у вторых.
В нуклеоиде бактерий содержится основная наследственная информация, которая реализуется в синтезе специфических белковых молекул. С ДНК бактериальной клетки связаны системы репликации, репарации, транскрипции и трансляции.
Нуклеоид в прокариотной клетке может быть выявлен в окрашенных препаратах с помощью светового или фазово-контрастного микроскопа. Для окрашивания ядерного вещества используется краситель Фельгена, который специфически окрашивает ДНК.
Метод окраски ДНК по Фельгену
1. Мазок из культуры бактерий фиксируют 2-3 мин метиловым спиртом и помещают в холодную 1% HCl на 1 мин.
2. Подвергают гидролизу при 60 ° С в 1% HCl 5-10 мин и споласкивают дистиллированной водой.
КАПСУЛА.
Капсула - слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий из полисахаридов (пневмококк) или полипептидов (бацилла сибирской язвы). Микрокапсулу (толщиной менее 0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий, четко выраженную макрокапсулу (толщиной более 0,2 мкм) формируют пневмококк, клебсиеллы, возбудитель сибирской язвы и некоторые другие. У патогенных бактерий капсула образуется в макроорганизме, на искусственных питательных средах она обычно утрачивается (за исключением клебсиелл).
В организме человека и животных капсула защищает патогенные бактерии от бактериофага, фагоцитоза и гуморальных факторов иммунитета, определяет антигенную специфичность микроорганизмов.
Капсулы, имея консистенцию геля, плохо удерживают краситель, и для их выявления чаще всего применяют методы негативного контрастирования.
Метод выявления капсулы по Бурри-Гинса.
ЖГУТИКИ.
Жгутики выполняют роль органа движения, позволяющего бактериям передвигаться со скоростью 20-60 мкм/сек. Бактерии могут иметь один (монотрихи) или несколько жгутиков, располагающихся по всей поверхности тела (перитрихи), либо собранные в пучки (лофотрихи).
Перитрихиальное расположение жгутиков характерно для энтеробактерий, возбудителей анаэробной инфекции, столбняка, ботулизма; монотрихом является холерный вибрион, лофотрихом - псевдомонас. У некоторых видов спирилл различают амфитрихиальное расположение жгутиков. Толщина жгутиков в среднем составляет 10-30 нм, а длина достигает 10-20 мкм.
Основу жгутика составляет длинная спиральная нить (фибрилла), которая у поверхности клеточной стенки переходит в утолщенную изогнутую структуру- крюк и прикрепляется к базальной грануле, вмонтированной в клеточную стенку и ЦПМ.
Рис. Схематическая модель базального конца жгутика Е. coli, основанная на электронных микрофотографиях выделенной органеллы (Стейниер Р. и др., 1979).
Базальные гранулы имеют диаметр около 40 нм и состоят из нескольких колец (одна пара у грамположительных бактерий, четыре - у грамотрицательных прокариот). Удаление пептидогликанового слоя клеточной стенки ведет к потере способности бактерий к движению, хотя жгутики при этом остаются неповрежденными.
Жгутики почти полностью состоят из белка флагеллина с некоторым содержанием углеводов и РНК.
Под микроскопом жгутики можно увидеть лишь после специальных методов протравливания и импрегнации солями серебра и ртути с последующей окраской метиленовой синью (метод Леффлера). При этом необходимо учитывать, что жгутики очень чувствительны к различным механическим воздействиям. О наличии жгутиков можно косвенно судить по направленному характеру движения в «висячей» и «раздавленной» капле в темнопольном и фазово-контрастном микроскопах, либо при светлопольной микроскопии при опущенном конденсоре и частично прикрытой диафрагме микроскопа.
Окраска жгутиков методом Леффлера.
В основе выявления жгутиков лежит осаждение на них красителя, чем достигается увеличение толщины жгутиков и уменьшение их прозрачности.
Препарат промывают водой.
ВОРСНИКИ (ФИБРИИ, ПИЛИ).
Поверхность энтеробактерий и нескольких других микроорганизмов покрыта большим числом (от 10 до нескольких тысяч) ворсинок - нитевидных образований белковой природы. Как и жгутики, они построены из одного вида белка - пилина, субъединицы которого организованны в виде полой внутри нити и берут начало от ЦПМ. Они короче и тоньше жгутиков, их ширина 10-12 нм и длина до 12 мкм.
Ворсинки полифункциональны: обеспечивают трансмиссивную передачу генов (конъюгация), являются рецепторами для фагов, органом прикрепления бактерий к питательному субстрату (адгезия), участвуют в транспорте метаболитов.
У стрептококков имеется наружный слой протеиновых волосков (фимбрий), которые получили название белок М (М-протеин). Этот белок играет важную роль в процессах взаимоотношений бактерий с макроорганизмом.
СПОРЫ.
Некоторые бактерии в конце периода активного роста способны образовывать споры. Этому предшествует обеднение среды питательными веществами, изменение ее рН, накопление ядовитых продуктов метаболизма. Как правило, одна бактериальная клетка образует одну спору - локализация спор различна (центральная, терминальная, субтерминальная).
Pис. Типичные формы спорообразующих клеток. 1. Спора расположена в центре; материнская клетка не увеличена (Bacillus megaterium). 2. Спора расположена терминально, материнская клетка не увеличена; заметны белковые включения (Bacillus thuringiensis). 3. Спора расположена терминально, материнская клетка раздута в форме булавы (Bacillus polymyxa). 4. Спора расположена в центре; материнская клетка деформирована и приобрела форму веретена - клостридиальная форма (Bacillus polymyxa). 5. Спора расположена терминально; круглая материнская клетка имеет форму барабанной палочки - плектридиальная форма (Bacillus sphaericus). 6. Спора расположена латерально; материнская клетка приобрела веретенообразную форму (Bacillus laterosporus) (Шлегель Г., 1987).
Если размеры спор не превышают поперечного размера палочковидной бактерии, то последняя называется бациллой (возбудитель сибирской язвы). Когда диаметр споры больше - бактерии имеют форму веретена и носят название клостридий (возбудители анаэробной инфекции). Клостридии столбняка имеют круглую спору и напоминают барабанные палочки. Клостридии ботулизма отличаются большими овальными спорами, что придает им вид теннисной ракетки. По химическому составу различие спор от вегетативных клеток состоит лишь в количественном содержании химических соединений. Споры содержат меньше воды и больше липидов.
Формирование спор связано с уплотнением и обособлением определенного участка цитоплазмы вегетативной клетки с последующим образованием внутри бактерии круглого или овального тельца, покрытого плотной многослойной оболочкой, которая пропитана большим количеством липидов, кальция, дипиколиновой кислоты.
Рис. Схема образования споры. А и Б. Образование септы. В и Г. Окружение протопласта споры протопластом материнской клетки. Д. Образование кортекса и оболочек споры. Е. Схема строения зрелой споры. 1 - экзоспориум; 2 - наружная оболочка споры; 3 - внутренняя оболочка споры; 4 - кортекс; 5 - клеточная стенка зародыша; 6 - цитоплазматическая мембрана; 7 - цитоплазма с ядерным веществом (Шлегель Г., 1987).
После полного созревания споры вегетативная часть клетки может лизироваться. Среди патогенных микробов способностью к спорообразованию обладают только палочковидные грамположительные бактерии. Большинство из них подвижны, благодаря перитрихиально расположенным жгутикам. В состоянии споры микроорганизмы метаболически неактивны, выдерживают высокую температуру (140-150 °С), воздействие химических дезинфицирующих веществ и длительно сохраняются в окружающей среде. Устойчивость к высокой температуре связана с очень низким содержанием воды и высоким содержанием дипиколиновой кислоты. Попадая в организм человека и животных, споры прорастают в вегетативные клетки. Процесс прорастания спор включает три стадии: активации, начальной стадии и стадии роста. К активирующим агентам, нарушающим состояние покоя, относят повышенную температуру, кислую реакцию среды, механические повреждения и др. Спора начинает поглощать воду, освобождается от дипиколата кальция, с помощью гидролитических ферментов разрушает многие собственные структурные компоненты. После разрушения наружных слоев наступает период формирования вегетативной клетки с активацией биосинтеза, заканчивающейся делением клетки. Окраску спор производят специальным методом, который включает предварительное прогревание споры, а также воздействие концентрированных растворов красок при высокой температуре.
Метод окраски спор по Ожешко.
1. На высушенный мазок наливают 0,5 % раствор хлористоводородной кислоты и подогревают 1-2 мин.
ФЕРМЕНТЫ БАКТЕРИЙ.
Питание микроорганизмов осуществляется благодаря наличию в клетке различных ферментов, катализирующих все жизненно необходимые реакции. Ферменты - это биологические катализаторы белковой природы. Микробная клетка, подобно клеткам высших организмов, оснащена достаточно активным ферментативным аппаратом. Ферменты микроорганизмов обладают теми же свойствами и функциями, что и ферменты высших организмов. В соответствии с катализирующими реакциями все ферменты разделяют на шесть классов:
- Оксидоредуктазы - катализируют реакции окисления-восстановления.
- Трансферазы - катализируют реакции переноса различных групп от донора к акцептору.
- Гидролазы - катализируют разрыв связей в субстратах с присоединением воды.
- Лиазы - катализируют реакции разрыва связей в субстрате без присоединения воды или окисления.
- Изомеразы - катализируют превращения в пределах одной молекулы (внутримолекулярные перестройки).
- Лигазы ( синтетазы ) - катализируют присоединение двух молекул с использованием энергии фосфатных связей.
Несмотря на малые размеры микробной клетки, распределение в ней ферментов строго упорядоченно. Ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ локализованы в цитоплазматической мембране и ее производных. Ферменты белкового синтеза связаны с рибосомами. Многие ферменты не связаны с определенными структурами клетки, а находятся в цитоплазме в растворенном виде.
Ферменты бактерий подразделяются на экз о- и эндоферменты . Эндоферменты функционируют только внутри клетки. Они катализируют реакции биосинтеза и энергетического обмена. Экзоферменты выделяются клеткой в среду и катализируют реакции гидролиза сложных органических соединений на более простые, доступные для ассимиляции микробной клеткой. К ним относятся гидролитические ферменты, играющие исключительно важную роль в питании микроорганизмов.
В зависимости от условий образования ферментов их разделяют на конститутивные и индуцибельные . Конститутивными называют ферменты, синтезируемые клеткой вне зависимости от субстрата, на котором развиваются бактерии. Например, ферменты гликолиза. Индуцибельные ферменты синтезируются только в ответ на присутствие в среде необходимого для клетки субстрата-индуктора. Он взаимодействует с репрессором, инактивирует его, в результате чего включается генетический аппарат клетки и начинается синтез соответствующего фермента. Индуцированный синтез ферментов идет, пока в среде присутствует индуктор. При этом ферменты синтезируются заново во всех клетках одновременно. Индукторами биосинтеза являются многие питательные вещества. К индуцибельным относится большинство гидролитических ферментов.
Среди сложных сред можно выделить избирательные или элективные среды. Они предназначены для выделения и культивирования определенного вида бактерий из материала, содержащего большое количество разных видов микроорганизмов. Например, для выделения возбудителя туберкулеза из мокроты больного используют среду Левинштейна-Йенсена , сальмонелл из испражнений - среду Плоскирева . В сложном составе таких сред содержатся вещества, ингибирующие рост посторонней микрофлоры, но не влияющие на жизнедеятельность искомого вида бактерий. Такими веществами могут быть анилиновые красители, желчь, хлористый натрий в концентрации выше 1%.
Разновидность элективных - селективные питательные среды . В их состав входят не только вещества, подавляющие рост отдельных групп микроорганизмов, но и стимуляторы роста отдельных видов бактерий.
Дифференциально-диагностические среды предназначены для идентификации бактерий по биохимическим свойствам. В основе использования этих сред лежат различия в ферментативном составе бактерий и способности ферментов расщеплять тот или иной субстрат. Существуют среды для определения гликолитической активности бактерий, в их состав входят один (среды Гисса), два (среды Ресселя ) или три (среда Клиглера ) сахара. Протеолитическую активность бактерий изучают на МПБ, средах с желатиной, свернутой сыворотке. Возможность ферментировать более простые азотсодержащие соединения изучают на питательных средах с аминокислотами, бульоне с мочевиной.
Способность бактерий к выделению токсинов и ферментов агрессии исследуют на кровяных агарах, желточно-солевом агаре , безсывороточном фосфатном агаре и других подобных средах.
Консервирующие среды используют для транспортировки и хранения в течение длительного времени материала, содержащего бактерии. В их состав входят глицерин, хлорид натрия и фосфатно-буферные растворы.
Питательные среды стерилизуют в автоклавах при разных режимах, которые зависят от состава среды или, если питательные среды содержат термолабильные компоненты, путем стерилизующей фильтрации.
Известны также ферменты, которые получили название аллостерических . Кроме активного центра у них имеется регуляторный или аллостерический центр, который в молекуле фермента пространственно разделен с активным центром. Аллостерическим (от греч. allos - иной, чужой) он называется потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром, по строению ( стерически ) не похожи на субстрат, но оказывают влияние на связывание и превращение субстрата в активном центре, изменяя его конфигурацию. Молекула фермента может иметь несколько аллостерических центров. Вещества, связывающиеся с аллостерическим центром, называют аллостерическими эффекторами. Они влияют через аллостерический центр на функцию активного центра: или облегчают ее, или затрудняют. Соответственно аллостерические эффекторы называются положительными (активаторы) или отрицательными (ингибиторы). Аллостерические ферменты играют важную роль в тонкой регуляции метаболизма бактерий. Поскольку практически все реакции в клетке катализируются ферментами, регуляция метаболизма сводится к регуляции интенсивности ферментативных реакций.
Некоторые ферменты, так называемые ферменты агрессии, разрушают ткани и клетки макроорганизма , обуславливая тем самым распространение патогенных микроорганизмов и их токсинов в инфицированных тканях. К таким ферментам относятся плазмокоагулаза , нейраминидаза, коллагеназа , лецитиназа , гиалуронидаза и некоторые другие ферменты. Гиалуронидаза стрептококков, например, расщепляет гиалуроновую кислоту в мембранах клеток соединительных тканей макроорганизма, что способствует распространению возбудителей и их токсинов в организме, обуславливая высокую инвазивность этих бактерий.
Плазмокоагулаза является главным фактором патогенности стафилококков, так как участвует в превращении протромбина в тромбин, который вызывает образование фибриногена, в результате чего каждая бактерия покрывается пленкой, предохраняющей ее от фагоцитоза. Ферменты микроорганизмов, такие как лигазы и рестриктазы , нашли широкое применение в биотехнологии, в том числе в генетической инженерии , для получения различных биологически активных веществ, гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, а также ряда продуктов в легкой и пищевой промышленности.
Ферменты микроорганизмов характеризуют их биологические свойства и поэтому их исследуют с целью идентификации бактерий. В зависимости от субстрата гидролитические ферменты принято делить на две большие группы:
· гидролитические или сахаролитические ферменты, субстратом для которых являются различные сахара, а продуктами их расщепления - кислоты, спирты, альдегиды, Н2О и СО2 ;
· протеолитические ферменты, расщепляющие белки с образованием полипептидов, аминокислот, аммиака, индола, сероводорода.
Для изучения активности ферментов при идентификации микроорганизмов широко используют дифференциально-диагностические среды, в состав которых входят определенные субстраты - сахара или белки.
При исследовании гидролитической активности бактерий распространены моносубстратные дифференциально-диагностические среды Гисса (пестрый ряд Гисса ), лактозосодержашие среды Эндо, Левина, Плоскирева , дисубстратные среды Ресселя , полисубстратные среды Клиглера и Олькеницкого . Последние могут служить и для изучения протеолитических свойств бактерий, так как рост микроорганизмов сопровождается высвобождением аммиака. Протеолитические ферменты бактерий определяются также по выделению индола, сероводорода, расщеплению некоторых аминокислот, например, фенилаланина , лизина, цистина . Протеолитические ферменты способны изменять (разжижать) желатину, причем, разные виды бактерий по разному изменяют «столбик» желатины в пробирке с посевом микроорганизма. Так, при росте холерного вибриона «столбик» желатины принимает форму гвоздя, при росте стафилококка - чулка, при росте синегнойной палочки наблюдается послойное разжижение среды.
Окислительно-восстановительные ферменты, дегидрогеназы, каталазу определяют по изменению органического красителя - акцептора водорода. Способность микроорганизмов использовать в качестве источника углерода цитрат оценивают в специальных тестах основанных на работе ферментов.
В практических бактериологических лабораториях широко применяют микр о- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.
МЕТОДЫ СТЕРИЛИЗАЦИИ.
Почти все факторы физического воздействия на микроорганизмы могут быть использованы с целью стерилизации. Под стерилизацией понимают обеспложивание, освобождение материалов, растворов, питательных сред от вегетативных и покоящихся форм микроорганизмов. Стерильность - понятие абсолютное, оно означает полное отсутствие микроорганизмов, как на поверхности, так и внутри стерильного объекта.
В практике широко используют несколько способов стерилизации: термическая (под действие высоких температур) и холодная (с помощью ультразвука, излучения, фильтрации).
Гибель клеток бактерий, грибов, дрожжей и вирусных частиц при стерилизации высокой температурой происходит либо в результате сгорания клеток, либо в результате коагуляции белковых структур микроорганизмов. Различают следующие способы тепловой стерилизации:
Прокаливание - это самый старый и надежный способ стерилизации. В пламени горелки прокаливают бактериологические петли, препаровальные иглы, кончики пинцетов и ножниц, предметные стекла. При этом бактерии, грибы и их споры сгорают.
Кипячение - для стерилизации металлических инструментов, стеклянных изделий, резиновых трубок, пробок используют кипящую воду. При 100 ° С (температура кипящей воды) вегетативные формы микроорганизмов и большинство вирусов погибают быстро, в течение нескольких минут. Споры (бациллы сибирской язвы, ботулизма) выдерживают кипячение в течение нескольких часов, вирусы гепатита В - около часа. Стерилизацию осуществляют в специальных металлических сосудах - стерилизаторах, которые могут быть снабжены электро-нагревом . Существует большое количество типов стерилизаторов, отличающихся по объему и устройству.
Стерилизация сухим жаром - Для стеклянной посуды чаще всего используют стерилизацию сухим жаром. Ее проводят в специальных суховоздушных ( сухожарочных ) шкафах, имеющих датчики - регуляторы температуры. Режимы стерилизации включают температуру и время. Наиболее часто используют следующие режимы стерилизации сухим жаром:
| Температура, ° С | Время, мин |
При таких режимах погибают как вегетативные формы, так и споры микроорганизмов.
Автоклавирование - стерилизация насыщенным паром под давлением. Проводится при температуре выше точки кипения воды. Это наиболее надежный и распространенный способ стерилизации. Особая эффективность этого способа достигается при совместном действии пара и высокой температуры. Стерилизацию паром под давлением осуществляют в специальных герметически закрывающихся аппаратах с толстыми стенками - автоклавах. Автоклав состоит из стерилизационной камеры, снабженной краном для выхода воздуха, манометром для измерения давления пара, предохранительным клапаном для выхода пара при повышении давления выше необходимого, термометра для измерения температуры внутри камеры. Имеется паровой котел с нагревателем воды. При кипячении воды пар поступает в камеру автоклава. Автоклав герметически закрывают крышкой или дверью с плотной резиновой прокладкой. Автоклавирование проводит специально подготовленный специалист, так как работа по обслуживанию аппарата, работающего под давлением требует подготовки и строгого соблюдения правил техники безопасности. Режим автоклавирования выражают в единицах избыточного давления и продолжительности времени. Избыточное давление в 1 атм устанавливается при достижении температуры в камере 121 °C, 1,5 атм - 125 °C , 2,0 атм - 134 °C . При таких режимах автоклавирования вегетативные формы микроорганизмов погибают в течение нескольких минут, а споры в течение 20-30 мин. Режим стерилизации выбирают в зависимости от свой ств ст ерилизуемого материала. Так, питательные среды стерилизуют 20-30 мин при 1 атм , перевязочный материал и резиновые изделия от 1 до 2 часов при 1,0-1,5 атм. Для контроля режима стерилизации используют вещества с определенной температурой плавления. Их смешивают с метиленовой синью, помещают в ампулы или небольшие флаконы и раскладывают в автоклаве перед началом автоклавирования . К таким контролирующим веществам относятся бензаурин , температура плавления 115 °C , соответствует - 0,5 атм ; бензойная кислота, температура плавления 121 °C , соответствует - 1,0 атм ; мочевина, температура плавления 132 °C, соответствует - 2,0 атм ; глюкоза, температура плавления 146 °C; тиомочевина , температура плавления 180 °C . Эти вещества расплавляются при достижении в сосуде соответствующей температуры и окрашиваются в цвет добавленного красителя.
Стерилизации текучим паром подвергаются те растворы и питательные среды, которые разрушаются при стерилизации под давлением. Такую стерилизацию проводят также в автоклавах при избыточном нулевом давлении и температуре 100 °C . Применяют «дробную стерилизацию» - трех- или четырехкратную обработку с интервалом в 1 сутки , во время которого не успевшие погибнуть споры бактерий прорастают в вегетативные формы и погибают от действия пара и температур.
Пастеризация предусматривает уничтожение в материале только вегетативных форм микроорганизмов и применяется в пищевой промышленности. При этом используют кратковременное нагревание до 90-92 °С в течение 2-5 сек или более длительное - в течение 5-10 мин нагревание до 70-75 °С . Обработанные таким образом материалы считаются пастеризованными, но не стерильными, так как содержат споры.
Холодная стерилизация осуществляется в отношении материалов, сред и растворов, которые изменяют свойства при тепловой стерилизации. Стерилизация фильтрованием показана для синтетических сред определенного состава, содержащих термолабильные аминокислоты, витамины, белки, для антибиотиков, ароматических углеводородов. Фильтрование проводится через мелкопористые материалы, которые адсорбируют клетки микроорганизмов: каолин, асбест, фарфор и др. Диски, изготовленные из асбеста с целлюлозой называют фильтрами Зейтца . Их помещают в специальный фильтродержатель и стерилизуют в автоклаве, а затем, смонтировав держатель с колбой или бутылью, под давлением пропускают стерилизуемый раствор. Широкое применение нашли мембранные фильтры. Их изготавливают из специально обработанной нитроцеллюлозы. Фильтры имеют поры размером от 0,22 до 100 мм. В фильтродержатели монтируют фильтры с разной величиной пор, от больших к меньшим и при фильтрации растворов постепенно «отсеивают» микроорганизмы различных размеров. Наиболее широко известны фильтрующие пластины фирм « Миллипор », « Синпор », « Владипор ». После стерилизующей фильтрации среды и растворы обязательно проверяют на стерильность, помещая микропробы простерилизованных растворов в термостат при температуре 37 ° С.
МИКРОФЛОРА ПОЧВЫ.
Почва является главным резервуаром и естественной средой обитания микроорганизмов, которые принимают участие в процессах формирования и очищения почвы, а также круговорота веществ в природе.
Жизнедеятельность микроорганизмов в почве, их качественный и количественный состав определяется почвенными условиями: наличием питательных веществ, влажностью, аэрацией, реакцией среды, температурой и т.д.
Большое влияние, как на общую численность, так и на соотношение отдельных систематических групп микроорганизмов оказывает тип почвы. Различаясь по физическим и химическим свойствам почва представляет различную среду для жизнедеятельности микроорганизмов. Их больше в увлажненной и обработанной почве (4,2-5,2 млрд/г), меньше в лесной почве, в песках (0,9-1,2 млрд/г). Наиболее обильна микрофлора в верхнем горизонте почвы глубиной 2,5-15 см. В этом слое протекают основные биохимические процессы превращения органических веществ, обусловленные жизнедеятельностью микроорганизмов. На глубине 4-5 м число микроорганизмов значительно снижается, так как уменьшается количество питательных веществ и ухудшаются условия аэрации
В составе микрофлоры почвы выделяют следующие группы микроорганизмов:
- бактерии аммонификаторы, вызывающие гниение трупов животных, остатков растений, разложение мочевины с образованием аммиака и других продуктов: аэробные бактерии - B . subtilis , B . mesentericus , Serratia marcescens ; бактерии рода Proteus ; грибы рода Aspergillus , Mucor , Penicillium ; анаэробы - C . sporogenes , C . putrificum ; уробактерии - Urobacillus pasteuri , Sarcina urea , расщепляющие мочевину;
- нитрифицирующие бактерии: Nitrobacter и Nitrosomonas ( Nitrosomonas окисляют аммиак до азотистой кислоты, образуя нитриты, Nitrobacter превращают азотистую кислоту в азотную и нитраты);
- азотфиксирующие бактерии: усваивают из воздуха свободный кислород и в процессе своей жизнедеятельности из молекулярного азота синтезируют белки и другие органические соединения азота, используемые растениями;
- бактерии, участвующие в круговороте серы, железа, фосфора и других элементов - серобактерии, железобактерии и т.д. (серобактерии окисляют сероводород до серной кислоты, железобактерии окисляют соединения железа до гидрата окиси железа, фосфорные бактерии способствуют образованию легко растворимых соединений фосфора);
- бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие брожение (молочнокислые, спиртовые, маслянокислые, уксусные, протионовые и др.).
С выделениями человека и животных, с фекально-бытовыми сточными водами в почву могут попадать патогенные и условно-патогенные микроорганизмы (возбудители грибковых заболеваний, ботулизма, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы, бруцеллеза, лептоспироза, кишечных инфекций и др.).
Санитарно-бактериологическое исследование почвы
При исследовании почвы может проводиться полный или краткий анализ. Полный санитарно-бактериологический анализ почвы проводится:
- для подробной и глубокой характеристики санитарного состояния почвы;
- для определения пригодности почвы при размещении жилья, мест отдыха, детских учреждений и водопроводных сооружений;
- для эпидемиологических