Пассивный транспорт - диффузия

Создаваемые работой насосов градиенты дают ионам возможность перемещаться через мембрану от большего энергетического уровня к меньшему путём диффузии, если, конечно, есть открытые ионные каналы. Такой канал - это крупномолекулярный интегральный белок, молекула которого проходит через двойной слой мембранных липидов. В этой молекуле есть заполненная водой пора, диаметр которой не превышает 1 нм. Через такое отверстие способны пройти только ионы калия (Рис. 4.2).

Радиус иона калия - 0,133 нм, у иона натрия он даже меньше - 0, 098 нм, тем не менее, через постоянно открытые каналы может проходить лишь калий. Дело в том, что истинные размеры иона определяются толщиной его гидратной оболочки, которой в водном растворе покрываются все ионы. Молекулы воды ведут себя как диполи: электроны их атомов кислорода сильнее, чем у атомов водорода, а значит кислород несёт слабый отрицательный заряд. Именно поэтому молекулы воды притягиваются положительными зарядами катионов калия, натрия и кальция. Но, поскольку у атомов водорода в молекуле воды есть слабый положительный заряд, существует притяжение водных молекул и к анионам хлора.

При меньшем ионном радиусе электрическое поле у иона натрия сильнее, чем у калия, а потому гидратная оболочка у него толще. Она и не позволяет ионам натрия проходить через каналы, оказывающиеся доступными для прохождения одного лишь калия. Вот почему в состоянии покоя клеточной мембраны через неё происходит ток преимущественно одной разновидности ионов - калия, постоянно уходящего из клетки по концентрационному градиенту.

Управляемые каналы

Только что описанные каналы, через которые проходят ионы калия, открыты всегда: и в состоянии покоя, и при возбуждении клетки - они мало зависят от внешних условий и поэтому являются каналами пассивного типа. В противоположность этому существуют управляемые ионные каналы, большинство из которых в состоянии покоя клетки закрыты, а для того, чтобы их открыть, необходимо каким-то образом на них подействовать. Следовательно, такие каналы являются управляемыми, а в зависимости от способа управления их подразделяют на три типа:

1) потенциалзависимые;

2) хемозависимые;

3) управляемые механически.

Устройство, с помощью которого открываются или закрываются каналы, часто называют воротным механизмом или даже воротами, хотя такое сравнение не вполне корректно. Современные представления об ионных каналах сложились в связи с двумя методическими подходами к их изучению. Во-первых, это метод локальной фиксации (англ. patch clamp), позволяющий наблюдать ток ионов через одиночный канал. Эту технику изобрели в конце 70-х годов Эрвин Неер и Берт Закман (Neher E., Sakmann B.), лауреаты Нобелевской премии 1991 года. Во-вторых, пониманию свойств каналов способствовало построение их моделей на основе расшифрованного генетического кода многих канальных белков и установленной в связи с этим аминокислотной последовательностью молекул.

Каждый канал образован несколькими белковыми субъединицами (Рис. 4.3), которые представляют собой длинные цепи аминокислот, скрученных в a-спираль. Форма a-спирали может меняться, например, в связи с изменением трансмембранной разности потенциалов (что исключительно важно для потенциалзависимых каналов). Изменение формы a-спирали приводит к перемещению аминокислот, в том числе несущих электрический заряд. В результате заряды таких аминокислот, как лизин или аргинин, могут оказаться во внутренней стенке ионного канала и сделать её гидрофильной: тогда покрытые гидратной оболочкой ионы смогут проходить через канал. Возвращение альфа-спирали к прежней форме приводит к тому, что во внутренней стенке канала снова оказываются гидрофобные участки и поэтому ток ионов прекращается.

В образовании разных типов каналов участвуют от двух до семи субъединиц, белковая цепь каждой субъединицы несколько раз пересекает клеточную мембрану, причём каждая область пересечения выполняет определённую задачу: одни образуют стенки канала, другие служат датчиками изменений электрического поля, третьи, выступающие за наружную сторону мембраны, являются рецепторами, четвёртые объединяют канал с цитоскелетом.

Потенциалзависимые каналы открываются или закрываются в связи с определёнными изменениями мембранного потенциала. Например, натриевые каналы в состоянии покоя закрыты, но, если мембранный потенциал уменьшится до критического значения, они открываются. Если деполяризация продолжится до положительного значения мембранного потенциала (т.е. на внутренней части мембраны окажется больше положительных зарядов, чем на наружной), то каналы закроются.

Хемозависимые каналы открываются вследствие присоединения нейромедиатора к выступающей наружу гликопротеиновой рецепторной области канального белка - такой тип каналов используется в синапсах (Рис. 4.4). Механически управляемые каналы характерны для чувствительных окончаний нейронов, реагирующих на растяжение и давление. Эти каналы особым способом связаны с цитоскелетом, что и приводит их к открытию при деформации клетки.

Сам момент открытия канала - всего лишь мгновение, длящееся миллионные доли секунды. Но и в открытом состоянии каналы находятся недолго - лишь несколько миллисекунд, после чего стремительно закрываются. Однако пропускная способность открытого канала поразительна: ток ионов происходит со скоростью до 100 000 000 ионов/с, что можно сравнить только с деятельностью самых "быстрых" ферментов, как, например, карбоангидраза, катализирующая образование и дегидратацию углекислоты в эритроцитах крови.

Кроме открытого и закрытого конформационных состояний каналы могут стать инактивированными: это значит, что они закрыты, но не подчиняются, как обычно, действию механизмов управления и не открываются. Состояние инактивации наблюдается немедленно после закрытия каналов, продолжается несколько мс и контролируется особыми субъединицами или особыми регионами белковой молекулы. Во время инактивации каналов клетка перестаёт отвечать на возбуждающие её стимулы, что определяется термином рефрактерность, т.е. временная невозбудимость.

Ионные каналы имеются в мембране любой клетки организма, но в мышечных и особенно в нервных клетках их плотность намного больше, чем в клетках других тканей. В нейронах, кроме высокой плотности каналов, обнаружено и их большое разнообразие. Это не случайно, поскольку именно каналы определяют условия возникновения электрических сигналов, характер самих сигналов, скорость их проведения и т.п., что собственно и позволяет нейронам выполнять свою главную задачу: принимать, перерабатывать и передавать информацию.

Блокаторы ионных каналов

Существует довольно много веществ, способных обратимо или необратимо связываться с молекулами канальных белков и, тем самым, блокировать их, т.е. выводить из подчинения управляющим механизмам. Блокированные каналы чаще всего оказываются закрытыми, хотя в некоторых случаях фиксируется открытое положение канала.

Блокировать каналы способны многие из давно известных ядов животного или растительного происхождения. Так, например, во внутренностях некоторых сростночелюстных рыб (Tetrodontiformes) содержится тетродотоксин, блокирующий натриевые каналы. К этому отряду относится печально знаменитая рыба фугу, унёсшая жизни немалого количества гурманов, а также плавающая в водах залива Петра Великого собака-рыба, способная раздуваться и издавать при этом довольно громкие звуки. Тетродотоксин достаточно давно применяется в экспериментальной практике, связанной с исследованием мембранной проницаемости.

Натриевые каналы может блокировать и другой животный яд - батрахотоксин , который содержится в слизи некоторых южноамериканских лягушек, например, пятнистого древолаза. Этим ядом индейцы отравляли свои стрелы, хотя и не догадывались, что батрахотоксин блокирует натриевые каналы, а такая блокада не позволяет нервным клеткам возбуждаться.

Другие южноамериканские индейцы готовили отравленные стрелы с помощью другого яда, растительного - это древесный сок кураре, добываемый из некоторых видов лиан. Яд кураре избирательно блокирует хемозависимые каналы нервно-мышечных синапсов. Эти же синапсы необратимо блокирует змеиный яд альфа-бунгаротоксин, который выделяют при укусе бунгары, они же крайты - близкие родственники кобр.

Вещество искусственного происхождения - тетраэтиламмоний специфически блокирует калиевые каналы; его часто использовали в экспериментальной практике. А в медицине применяют многие лекарственные вещества, точкой приложения которых являются ионные каналы: с помощью таких веществ можно управлять определёнными ионными каналами и тем самым влиять на активность нейронов.

Мембранный потенциал покоя

В покое на наружной стороне плазматической мембраны располагается тонкий слой положительных зарядов, а на внутренней стороне - отрицательных. Электрический заряд наружной поверхности принято считать нулевым, поэтому трансмембранная разность потенциалов или мембранный потенциал покоя имеет отрицательное значение. В типичном для большинства нейронов случае потенциал покоя равен приблизительно -60 - -70 мВ.

Техника прямого измерения потенциала покоя была создана в конце 40-х годов ХХ века. Был изготовлен специальный измерительный электрод: тонкий стеклянный капилляр с оттянутым кончиком диаметром не более 1 мкм и заполненный проводящим электрический ток солевым раствором (3М КСl). который не изменяет внутренний заряд мембраны. В этот раствор с широкого конца капилляра вставляли металлический проводник, а тонким концом протыкали клеточную мембрану. Второй электрод представлял собой хлорированную серебряную пластинку и помещался во внешнюю среду; использовались усилитель слабых электрических сигналов и гальванометр (Рис. 4.5). Объектом исследования был гигантский аксон кальмара, именно на нём удалось получить данные, послужившие основой для мембранной теории (Hodgkin & Huxley).

Как же возникает мембранный потенциал покоя? Прежде, чем ответить на этот вопрос, следует ещё раз напомнить, что работой натрий-калиевого насоса в клетке создаётся высокая концентрация ионов калия, а в клеточной мембране для этих ионов есть открытые каналы. Выходящие из клетки по концентрационному градиенту ионы калия увеличивают количество положительных зарядов на наружной поверхности мембраны. В клетке много крупномолекулярных органических анионов и потому изнутри мембрана оказывается заряженной отрицательно. Все остальные ионы могут проходить через покоящуюся мембрану в очень небольшом количестве, их каналы, в основном, закрыты. Следовательно, потенциал покоя обязан своим происхождением, главным образом, току ионов калия из клетки.

Это заключение достаточно просто проверить экспериментально. Если, например, искусственно повысить концентрацию ионов калия вокруг клетки, то их ток из клетки уменьшится или даже вовсе прекратится, поскольку уменьшится концентрационный градиент - движущая сила для этого тока. И тогда начнёт уменьшаться потенциал покоя, он может сделаться равным нулю, если концентрация калия по обе стороны мембраны окажется одинаковой. Есть ещё одна возможность доказать калиевую природу потенциала покоя. Если блокировать калиевые каналы тетраэтиламмонием, то ток ионов калия прекратится, а вслед за этим начнёт уменьшаться потенциал покоя.

Мембрана находящейся в покое клетки пропускает в небольшом количестве ионы натрия и хлора. Две силы гонят ионы натрия в клетку: высокая наружная концентрация и электроотрицательная внутренняя среда клетки. Даже небольшое количество вошедшего в клетку натрия приводит к деполяризации мембраны - уменьшению потенциала покоя. Ионам хлора попасть в клетку труднее, поскольку их отталкивает электроотрицательный слой зарядов на внутренней поверхности мембраны, а значение равновесного потенциала хлора -60 мВ мало отличается от нормальной величины потенциала покоя. Связь между избирательной проницаемостью мембраны для каждого из трёх видов ионов и их концентрациями описывает уравнение Гольдмана:

RT P k [K ] a + P na [Na ] a + P cl [Cl ] i

E m = ¾ ln ¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾¾

F P k [K ] i + P na [Na ] i + P cl [Cl ] a

где Е m - значение мембранного потенциала, Р - проницаемость мембраны, зависящая от её толщины и подвижности в ней иона, a - концентрация иона снаружи, i - концентрация его изнутри, R, T и F имеют то же значение, что и в уравнении Нернста.

Из этого уравнения следует, что реальное значение потенциала покоя (Еm = - 65 мВ) является компромиссным между равновесными потенциалами калия (- 75 мВ), натрия (+ 55 мВ) и хлора (- 60 мВ). Нетрудно предсказать, что повышение проницаемости мембраны для натрия приведёт к деполяризации, а увеличение её проницаемости для хлора - к гиперполяризации.

Если принять за 1 проницаемость мембраны в покое для ионов калия, то проницаемость её для ионов натрия составит 0,04, а для хлора - 0,45. Но при возбуждении мембраны это соотношение изменяется и на вершине пика потенциала действия составляет 1(К) : 20 (Na) : 0,45 (Cl).

Потенциал действия

Уравнение Гольдмана позволяет вычислить значение мембранного потенциала покоя, если известна концентрация ионов внутри клетки и снаружи, а также проницаемость для этих ионов. Реальная величина мембранного потенциала покоя ближе всего к значению равновесного потенциала для ионов калия, которые проходят через постоянно открытые для них каналы. Ситуация решительно изменяется при раздражении клетки, когда повышается натриевая проницаемость и появляется деполяризующий рецепторный потенциал или постсинаптический потенциал.

Потенциал действия возникает лишь при определённой величине деполяризующего сдвига, например, с -65 мВ до -55 мВ. Если деполяризация будет меньше, то потенциал действия не возникнет: такие деполяризующие сдвиги называются подпороговыми. Приведённые здесь цифры относительны, в разных клетках они могут быть меньше или больше, но всегда наименьший деполяризующий сдвиг, который вызовет появление потенциала действия, определяется, как пороговый.

Возникновение рецепторного или постсинаптического потенциалов связано со сравнительно небольшим местным повышением натриевой проницаемости мембраны. Вход ионов натрия в клетку и обусловленная этим местная деполяризация приводят к возникновению локального электрического тока. Его распространению вдоль мембраны препятствует электрическое сопротивление самой мембраны, поэтому начавшаяся в каком-нибудь месте пассивная деполяризация не может распространяться далеко - пассивные электрические ответы всегда локальны.

Но, если сумма локальных деполяризующих сдвигов всё-таки сможет деполяризовать мембрану триггерной зоны нейрона до критического уровня, до порогового значения, то произойдёт активный и максимальный ответ клетки по правилу "всё или ничего". Деполяризация до критического значения ведёт к конформационным изменениям внутренней стенки натриевых каналов и перемещению полярных аминокислот. Вследствие этого открывается пора диаметром 0,3 - 0,5 нм через которую могут пройти катионы натрия (См. рис. 4.3). Ток анионов через этот канал невозможен, поскольку его устье содержит отрицательные заряды карбоксильных групп глутаминовой кислоты, которые отталкивают отрицательные заряды анионов.

Равновесный потенциал натрия +55 мВ, а каналы для него открываются при значении мембранного потенциала -55 мВ, поэтому ионы натрия поступают в клетку с высокой скоростью: до 10⁷ ионов/с через одиночный канал. Плотность натриевых каналов варьирует от 1 до 50 на одном квадратном микрометре. В результате этого за 0,2 - 0, 5 мс значение мембранного потенциала из отрицательного (-55 мВ) становится положительным ( около +30 мВ), хотя и не достигает значения равновесного натриевого потенциала.

Такая стремительная деполяризация является саморегенерирующей: чем больше входит натрия в клетку и чем больше сдвиг мембранного потенциала, тем больше открывается натриевых каналов и тогда ещё больше натрия входит в клетку:

Деполяризация

Ý ß

Ток натрия в клетку Ü Открытие натриевых каналов

По мере приближения величины мембранного потенциала к значению равновесного натриевого потенциала движущая сила для ионов натрия слабеет, но одновременно растёт движущая сила, заставляющая выходить из клетки ионы калия, каналы для которых постоянно открыты. Когда мембранный потенциал становится положительным, натриевые потенциалзависимые каналы закрываются, а ток калия из клетки резко увеличивается. В связи с этим происходит реполяризация, т.е. восстановление первоначального значения мембранного потенциала (иногда выходной ток калия приводит даже к кратковременной следовой гиперполяризации). Две фазы потенциала действия - деполяризация и реполяризация образуют пик или спайк потенциала действия (Рис. 4.6).

Само открытие натриевых каналов происходит необычайно быстро, в течение не более, чем 10 микросекунд (т.е. миллионных долей секунды), открытыми они остаются несколько миллисекунд, затем быстро закрываются, причём на некоторое время конформация канального белка становится такой, что его невозможно активировать, а значит и открыть каналы. Это состояние называется рефрактерностью, около 1 мс она абсолютна, а затем относительна: при абсолютной рефрактерности нельзя открыть каналы никаким действием, при относительной их нельзя активировать пороговой деполяризацией, но можно надпороговой.

Общая продолжительность рефрактерного состояния определяет максимальную частоту возбуждения нейрона. Например, если рефрактерный период продолжается 2 мс, то за 1с нейрон может возбуждаться максимум 500 раз (1 с = 1000 мс: 2мс = 500). Некоторые нейроны могут возбуждаться чаще, чем 500/с, другие - реже: в соответствии с этим первые можно назвать более лабильными, чем вторые. Проблему лабильности или функциональной подвижности клеток в конце XIX - начале ХХ века исследовал российский физиолог Н.Е.Введенский, он же ввёл в употребление понятие о мере лабильности, как о наибольшем числе электрических осцилляций, которое может воспроизвести за секунду нерв или мышца. Так, например, нерв, по данным Введенского, способен возбуждаться до 500/с, а мышца - лишь до 200/с, т.е. нерв является более лабильным объектом, чем мышца.