Работа № 1. Биологические свойства возбудителясифилиса и принципы лабораторной диагностики.

Занятие № 2.2.3

Спирохетозы. Лабораторная диагностика сифилиса, лептоспироза, боррелиозов

Цель: изучить биологические свойства спирохет и принципы лабораторной диагностики спирохетозов;классифицировать препараты для идентификации, лечения и профилактики спирохетозов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Возбудитель сифилиса. Таксономия, биологические свойства. Лабораторная диагностика.

2. Возбудитель лептоспироза. Таксономия, биологические свойства. Лабораторная диагностика.

3. Возбудители боррелиозов. Таксономия, биологические свойства. Лабораторная диагностика.

4. Эпидемиология, патогенез заболеваний, вызванных спирохетами.

5. Основные клинические проявления сифилиса, лептоспироза, боррелиоза.

6. Иммунитет при сифилисе, лептоспирозе, боррелиозе.

5. Методы специфической профилактики и терапии спирохетозов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• дифференцировать возбудителей спирохетозов по морфологическим признакам;

· интерпретировать результаты серологических реакций по определению антител в

сыворотке больных спирохетозом;

• классифицировать препараты в соответствии с их назначением.
  
  

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ: алгоритмом лабораторной диагностики инфекционных болезней;

методами анализа и оценки результатов лабораторной диагностики по выявлению возбудителейсифилиса, лептоспироза и боррелиозов.

Работа № 1. Биологические свойства возбудителясифилиса и принципы лабораторной диагностики.

Самостоятельная работа:решить ситуационную задачу, используя демонстрационный материал и теоретическую справку.

В кожно-венерологический диспансер к врачу-венерологу обратилась девушка, у которой врач на слизистой нижней губы обнаружил безболезненную язву, с плотным дном и подрытыми плотными краями. Из анамнеза было выяснено, что девушка была в контакте с незнакомым мужчиной около 1,5 мес. назад. На основании клинических данных и основываясь на анамнезе, врач поставил предварительный диагноз: «Первичный сифилис».

1. Какие направления и методы лабораторной диагностики могут быть использованы для подтверждения диагноза? Какой материал необходимо взять для исследования?

А)___________________________________________________________________________

Treponemapallidum (окраска по Романовскому-Гимзе)

Результат___________________________________________________

___________________________________________________________

___________________________________________________________

___________________________________________________________

Treponemapallidum (нативный препарат)

Результат___________________________________________________

___________________________________________________________

___________________________________________________________

___________________________________________________________

2. В какой период заболевания применяются эти методы и для чего?

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Б)___________________________________________________________________________

Экспресс-диагностика сифилиса (реакция микропреципитации)

Учестьрезультат экспресс-метода серологического обследования на сифилис.В какой период заболевания применяется?

При массовом обследовании населения используют экспресс-метод обсле­дования на сифилис. Этот метод дает значимый процент ошибки, поэтому все положительные результаты подтверждаются другими серологическими реак­циями (р. Вассермана, осадочные реакции).

Сыворотки обследуемых
Ингредиенты
1. Инактивированная сыворот­ка больного	З к	З к	З к	З к	З к
2. Эмульсия кардиолипинового антигена	1 к	1 к	1 к	1 к	1 к
Ингредиенты перемешать (или встряхнуть, если реакция в планшете)
3. Физиологиче­ский раствор	1 к	1 к	1 к	1 к	1 к
После выпадения хлопьев, учесть результат

Примечание: для демонстрации дается эталон учета результатов.

Положительная реакция (крупные хлопья)	Слабоположительная(хлопья средней величи­ны и мелкие)	Отрицательная (нет хлопьев)
++++ +++	++ +	-

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

Реакция Вассермана

Учестьрезультат готовой реакции Вассермана, поставленной с целью выявления антител в сыворотке крови больного с подозрением на сифилис. Сделать вывод.В какой период заболевания применяется?

Методические указания

Реакцию ставят по принципу реакции связывания комплемента. Отличием является то, что при постановке реакции Вассерманаможет быть использован неспецифический антиген - липидная вытяжка бычье­го сердца. Возможность использования такого антигена объясняется тем, что в сыворотке крови больного повышается содержание глобулинов и изменяется степень их дисперсности. Глобулины, вступая в соединение с липидньми экс­трактами, образуют комплекс, который связывает комплемент, и, поэтому гемо­лиз не происходит (в гемолитической системе). Отсутствие гемолиза - положи­тельная реакция - серологически подтверждает диагноз "сифилис". При поста­новке серологических реакций можно использовать специфические антигены из тканевых трепонем и культуральные.

Направление:___________________________________________________________________

Ингредиенты:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

Механизм:

Постановка:

Аг1 Аг2 Аг3 КС КА КГС

Результат:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

Методические указания

К тканевым живым трепонемам прибавляют исследуемую сыворотку больного с подозрением на сифилис. Через несколько минут трепонемы теряют способность двигаться. Методика постановки реакции: все пробирки выдерживают в анаэростате при 35⁰С 20 часов, готовят пре­парат "раздавленная капля" и микроскопируют в темном поле зрения. Процент иммобилизованных трепонем определяют по формуле:

х= Тк - То х 100, где

Т_к

Тк - число подвижных трепонем в контроле (с инактивированным комплементом)

То - число подвижных трепонем в опыте

Учесть результат опыта при: Тк=30, То=12

Результат: положительный - процент иммобилизации выше 50; отри­цательный - ниже 20; слабо положительный, сомнительный - 30-50, 20-30.

Ингредиенты	Пробирки
	"К-1"на подвижность	"К-2" на комплемент	"О" на выявление ат
Сыворотка здоро­вого	+	-	-
Сыворотка больно­го	-	+	+
Физ. р-р	+	+	+
Комплемент инактивированный	-	+	-
Комплемент активный	+	-	+
Живые тканевые трепонемы	+	+	+
Результат:	подвижность	подвижность	Подвижность/ иммобилизация

Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лептоспирозный диагностикум

2._____________________________________________________________________________

3._____________________________________________________________________________

4._____________________________________________________________________________

5._____________________________________________________________________________

6._____________________________________________________________________________

II. Решить ситуационные задачи:

Задача 1.У двух бе­ременных женщин (А. иС.) положительная реакция микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (положительная и слабоположительная соответственно). При осмотре обеих пациенток выявлена сыпь. Кровь жен­щин была отправлена для постановки реакции Вассермана. Для решения задачи прилагаются результаты реакции Вассермана пациенток А. и С. (положительный у пациентки А. и отрицательный у пациентки С.).

Оцените результаты исследования и сделайте вывод, ответив на вопросы:

Вопрос	Ответ
1. У кого из женщин подтверждается диагноз сифилиса и почему?
2. Можно ли определить стадию заболевания и по каким призна­кам?
3. Возможно ли внутриутробное заражение плода?Если – да, то каким путем?
4. Объяснить слабоположительный результат реакции микропеципитации у здоровой беременной женщины.

Задача 2. В женскую консультацию обратилась беременная женщина с жалобами насыпь. Кровь женщины была отправлена для постановки реакции Вассермана. Оценить результаты исследования. Результат реакции с тремя антигенами положительный.

Оцените результаты исследования и сделайте вывод, ответив на вопросы:

Вопрос	Ответ
1. Подтверждается ли диагноз сифилиса и почему?
2. Можно ли определить стадию заболевания и по каким признакам?
3. Объяснить положительный результат реакции Вассермана.
4. Какие исследования нужно провести для подтверждения диагноза?

Задача 3.К врачу-хирургу на прием пришла женщина-гениколог с жалобами на возникновение банального панариция на указательном пальце правой руки. Пыталась лечиться местно мазями с антибиотиком, эффект был, но не значительный. При осмотре на концевой фаланге имеется булавовидное вздутие на фоне клеточной инфильтрации, без островоспалительной эритемы и сильные стреляющие боли. Лимфатические узлы увеличены в области локтевого сустава. Из анамнеза: на вечернем дежурстве месяц назад, по скорой, была доставлена женщина с кровотечением, подобранная на улице; при оказании помощи врач не надела перчатки.

Ответить на вопросы:

Вопрос	Ответ
1. Ваш предварительный диагноз?
2. Этиология заболевания?
3. Пути заражения?В течение какого периода человек наиболее заразен?
4. Как могла заразиться пациентка?
5. Какие исследования могут подтвердить диагноз?

Задача 4. В местности, эндемичной по лептоспирозу, после купания в пруду заболел ребенок. Был подтвержден диагноз: «Лептоспироз» в реакции РСК.

Оцените результаты исследования и сделайте вывод, ответив на вопросы:

Вопрос	Ответ
1. Инкубационный период при лептоспирозе?
2. Какова цель постановки РСК в данном случае? (Выявление аг или ат)?
3. Опишите реакцию по схеме.
3. Какой из специфических препаратов Вы предложите для лечения? И почему?
4. Какой специфический препарат и кому следует назначать для улучшения эпидемической ситуации? Как долго сохраняется иммунитет?

Задача 5. В клинику поступил больной с лихорадочным заболеванием на 8-й день болезни. Местность, где проживал больной, неблагополучна по лептоспирозу. У больного была дважды взята кровь - в момент поступления и через неделю. Кровь направлена на исследования для определения специфических антител с лептоспирозным диагностикумом в реакции связывания комплемента. Отмечено 4-х кратное увеличение титра антител.

Оцените результаты исследования и сделайте вывод, ответив на вопросы:

Вопрос	Ответ
1. Описать реакцию по схеме.
2. Подтвержден ли диагноз лептоспироза? Обоснуйте диагностическую значимость проведенного исследования.
3. Какой из специфических препаратов Вы предложите для лечения?
4. Профилактика лептоспироза (специфическая и неспецифическая)?

Задача 6.Больной С., 34 года, поступил в инфекционную клинику 25.05 на 2 день болезни с жалобами на головную боль, озноб, повышенную температуру до 38,5°С, общую слабость и боли в мышцах. При осмотре у больного выявлены незначительная ригидность мышц затылка. Менингеальных и очаговых симптомов не было. Из анамнеза выяснено, что 10 дней назад удалил присосавшегося клеща в правой подмышечной области, где на 4 день появилась эритема размером 5,5х6,0 см. Серопрофилактика КЭ проведена в день удаления клеща. Экстренной антибиотикопрофилактики ИКБ не было.

Оцените результаты исследования и сделайте вывод, ответив на вопросы:

Вопрос	Ответ
1. Предварительный диагноз?
2. План обследования?
3. Инкубационный период заболевания? Этапы патогенеза?
4. Профилактика и лечение заболевания?

Задача 7.Больной В., 45 лет, поступил в декабре в клинику инфекционных болезней с жалобами на постоянные (свыше 6 месяцев) головные боли, быструю утомляемость, ухудшение памяти и концентрации внимания, расстройство сна, боли в коленных и локтевых суставах. Из эпидемиологического анамнеза установлено, что в конце мая отмечал присасывание клеща. В пункт серопрофилактики клещевых инфекций не обращался, профилактику не проводил. Кровь пациента была отправлена на серологическое исследование.

Оцените результаты исследования и сделайте вывод, ответив на вопросы:

Вопрос	Ответ
1. Предварительный диагноз?
2. Путь заражения.
3. Патогенез заболевания
4. Методы диагностики.
5. Оценить результат ИФА на обнаружение IgM и IgG к боррелиозному АГ. Диагностический титр?
6. Каковы методы профилактики и лечения?

Теоретическая справка

Принципиальные схемы лабораторной диагно­стики спирохетозов

Диагностика лептоспироза

Исследование проводят в лаборатории особо опасных инфекционных болезней. Диагноз лептоспироза подтверждают следующими методами:

♦ бактериоскопический (экспресс-метод). В первые дни больным проводят микроскопию крови в темном поле, а с 6-7-го дня и микроскопию мочи.

♦ серологический (основной метод). Очень чувствительная реакция микроагглютинации (РМА) с парными сыворотками крови, взятыми на 1-й неделе болезни и через 7-10 дней.

Диагностическое значение имеет нарастание титра антител к лептоспирам в 4 раза и более. Иногда антитела появляются даже через 1 месяц и позже. Для РМА берут 3-4 мл крови из вены. Весьма перспективны иммуноферментный и радиоиммунный методы;

♦ с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно обнаружить лептоспиры с первых дней болезни, даже если их количество ничтожно;

♦ бактериологический (дополнительный метод). Высевают кровь, мочу, спинномозговую жидкость на специальные среды (Уленгута, Терских и другие). Однако лептоспиры растут долго – в течение 30 суток, а частота выделения их невелика;

♦ биологический (дополнительный метод). Гвинейским свинкам или молодым золотистым хомякам вводят внутрибрюшинно или наносят на скарифицированную рану кровь больного, мочу или ликвор, при наличии лептоспир заболевание развивается примерно через неделю (желтуха, кровотечение).

Наиболее распространенный метод исследования – реакция микроагглютинации-лизиса с живыми антигенами. Может быть использована РСК, а также реакция макроагглютинации с убитым антигеном. Агглютинины, лизины и комплементсвязывающие антитела появляются в крови на 3-5-й день болезни и максимально накапливаются на 8-10-й день, титр сыворотки в этих случаях равен1:10000-1:50000.

Диагностика Лайм-боррелиоза

Ранняя диагностика основывается на клинико-эпидемиологических данных. При классической картине мигрирующей эритемы диагноз ставится по клиническим признакам, диагноз регистрируют даже при отсутствии лабораторного подтверждения и данных об укусе клеща. В остальных случаях диагноз подтверждают лабораторными методами. Посев, выявление антигена возбудителя и гистологическое исследование кожи недостаточно чувствительны и специфичны, гистологическое исследование, кроме того,инвазивно. Поэтому диагноз подтверждают, в основном, серологическими методами - выявлением в крови специфических антител к возбудителю. ПЦР-тестирование на наличие генетического материала возбудителя в данном случае малоэффективно.

Антитела к Borreliaburgdorferi класса IgM выявляются через 1 - 3 недели после инфицирования. Максимальное количество IgG-антител синтезируется через 1,5 - 3 месяца после инфицирования. Антитела класса IgG часто не выявляются на ранней, локализованной стадии заболевания или при рано назначенной антимикробной терапии. Антитела класса IgG циркулируют в крови длительный срок (от нескольких месяцев до нескольких лет), даже после успешной антимикробной терапии и излечения инфекции. Иммунитет против боррелий не является стерильным. У переболевших людей возможно повторное заражение через несколько лет. Ложноположительные результаты определения антител класса IgG к боррелиям могут быть обусловлены присутствием в крови специфических антител при заболеваниях, вызываемых спирохетами (сифилис, возвратный тиф); низкий уровень антител IgG возможен при инфекционном мононуклеозе, гепатите B, ревматических болезнях (СКВ), заболеваниях периодонта, у 5 – 15 % здоровых лиц из эпидемической зоны.

Положительный результат исследования свидетельствует о текущей или перенесенной в прошлом инфекции. Это может иногда приводить к неверной оценке результатов исследования, если клиническая картина заболевания нетипична.

Отрицательный результат исследования может быть при отсутствии инфицирования, при проведении исследования в ранние сроки заболевания или в отдалённые сроки после перенесенной инфекции. Нужно помнить, что отсутствие антител не исключает раннюю инфекцию, но действительно исключает хроническийборрелиоз.

В принципе, на основании только серологических исследований нельзя определить необходимость назначения лечения и нельзя оценить эффективность терапии. Эти проблемы должны решаться индивидуально с учётом клинических данных.

Для лабораторной диагностики используют серологическое исследование крови в непрямой реакции иммунофлюоресценции (нРИФ) с антигеном из боррелий. Положительной реакцией считают нарастание титра антител через Знедели от начала заболевания в 2 раза. При отсутствии нарастания титра антител в динамике диагностическим является титр 1 : 40.На поздних сроках заболевания положительная нРИФ в титре 1 : 40 и выше, вероятно, свидетельствует о хроническом или латентном течении болезни Лайма. Для выявления антител классов IgM и IgG используется ИФА. Среди перспективных методов диагностики боррелиоза - вестернблот и ПЦР.

Занятие № 2.2.3

Спирохетозы. Лабораторная диагностика сифилиса, лептоспироза, боррелиозов

Цель: изучить биологические свойства спирохет и принципы лабораторной диагностики спирохетозов;классифицировать препараты для идентификации, лечения и профилактики спирохетозов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:

1. Возбудитель сифилиса. Таксономия, биологические свойства. Лабораторная диагностика.

2. Возбудитель лептоспироза. Таксономия, биологические свойства. Лабораторная диагностика.

3. Возбудители боррелиозов. Таксономия, биологические свойства. Лабораторная диагностика.

4. Эпидемиология, патогенез заболеваний, вызванных спирохетами.

5. Основные клинические проявления сифилиса, лептоспироза, боррелиоза.

6. Иммунитет при сифилисе, лептоспирозе, боррелиозе.

5. Методы специфической профилактики и терапии спирохетозов.

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:

• дифференцировать возбудителей спирохетозов по морфологическим признакам;

· интерпретировать результаты серологических реакций по определению антител в

сыворотке больных спирохетозом;

• классифицировать препараты в соответствии с их назначением.
  
  

СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ВЛАДЕТЬ: алгоритмом лабораторной диагностики инфекционных болезней;

методами анализа и оценки результатов лабораторной диагностики по выявлению возбудителейсифилиса, лептоспироза и боррелиозов.

Работа № 1. Биологические свойства возбудителясифилиса и принципы лабораторной диагностики.

Самостоятельная работа:решить ситуационную задачу, используя демонстрационный материал и теоретическую справку.

В кожно-венерологический диспансер к врачу-венерологу обратилась девушка, у которой врач на слизистой нижней губы обнаружил безболезненную язву, с плотным дном и подрытыми плотными краями. Из анамнеза было выяснено, что девушка была в контакте с незнакомым мужчиной около 1,5 мес. назад. На основании клинических данных и основываясь на анамнезе, врач поставил предварительный диагноз: «Первичный сифилис».

1. Какие направления и методы лабораторной диагностики могут быть использованы для подтверждения диагноза? Какой материал необходимо взять для исследования?

А)___________________________________________________________________________