Правила и этапы приготовления препаратов для гистологического исследования
3.1.Определите суть следующих основных понятий
| Биопсия | Метод исследования, при котором проводится прижизненный забор клеток или тканей (биоптата) из организма с диагностической или исследовательской целью. Биопсия является обязательным методом подтверждения диагноза при подозрении на наличие онкологических заболеваний. |
| Фиксация | Метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. |
| Обезвоживание | Способ удаления воды из различных материалов с целью получения обезвоженного продукта. |
| Уплотнение или заливка | Процесс создания блока, достаточно твердого, чтобы быть пригодным для резки (микротомирования). |
| Микротомия | Подготовка гистологических срезов при помощи микротома для последующего микроскопического исследования. |
| Базофилия | Химическое сродство к основаниям, в том числе, к осно́вным красителям. Базофилией в гистологии называют способность клеточных структур окрашиваться основными (щелочными) красителями (азуром, пиронином, гематоксилином и др.), обусловленная кислотными свойствами окрашивающихся компонентов клетки, главным образом нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). |
| Оксифилия | Свойство цитоплазмы и других элементов клетки или волокнистых структур окрашиваться кислыми красителями (эозином, кислым фуксином и др.) |
| Гистохимия | Раздел гистологии, изучающий локализацию различных химических веществ и продуктов их метаболизма в тканях. |
| Авторадиография | Метод изучения распределения радиоактивных веществ в исследуемом объекте наложением на объект чувствительной к радиоактивным излучениям фотоэмульсии. |
| Иммуноцитохимия | Метод морфологической диагностики, в основе которого лежит визуализация и оценка с помощью микроскопа результатов реакции антиген-антитело непосредственно в гистологических срезах. |
| Световая микроскопия | Микроскопия, при которой увеличенное изображение получают с помощью оптического прибора (микроскопа), в структуру которого входят компоненты, использующие пучок света для создания видимого поля. |
| Электронная микроскопия | Совокупность методов исследования с помощью электронных микроскопов микроструктур тел, их локального состава и локализованных на поверхностях или в микрообъемах тел электрических и магнитных полей. |
| Сканирующая микроскопия | Метод анализа поверхностной структуры микрообъекта путем анализа отраженного «электронного изображения» (как правило, при специальном напылении и с применением метода замораживания-высушивания, что позволяет повышать электронную плотность объекта и предотвращать деформации клеточных и др. структур). |
| Морфометрия | Включает совокупность приемов и методов определения геометрических характеристик исследовательских объектов-гистологических препаратов (срезов, мазков, отпечатков и т.п.) и микрофотографий. |
3.2. Отметьте в таблице название основных этапов изготовления гистологического препарата и укажите кратко сущность каждого из них
| Этапы изготовления гистологического препарата | Сущность этапа |
| Взятие материала | Берут кусочки органов и тканей величиной не более 1 см³. Материал желательно получать как можно раньше после смерти людей (метод исследования материала трупа человека — аутопсия). С диагностической целью материал для гистологического исследования может забираться у людей прижизненно с помощью специальных инструментов или во время операций. Этот способ получения материала носит название биопсии. |
| Фиксация | Фиксация – метод обработки ткани с целью закрепления ее прижизненной структуры. Это достигается путем воздействия на ткань специальных растворов (фиксаторов). Наиболее существенным изменением, происходящим в тканях под воздействием фиксатора является процесс свертывания (коагуляции) белков. Количество фиксатора следует брать в 20-100 раз больше объема кусочка фиксируемого материала. |
| Помывка в воде | После фиксации материал промывают (чаще всего в течение нескольких часов в проточной воде) с тем, чтобы избавить его от избытка фиксатора и различных осадков фиксирующих жидкостей. Изучить с помощью микроскопа такие фиксированные кусочки органов невозможно, т.к. они не прозрачны. Чтобы кусочек органа можно было микроскопировать, его надо разрезать на очень тонкие пластинки – срезы. Такие срезы получают с помощью микротомов. для того, чтобы резать на микротоме кусочек ткани, ее надо предварительно уплотнить. Это достигается путем пропитывания застывающими жидкостями – расплавленным парафином. Парафин в воде не растворяется, и поэтому промытый после фиксации кусочек ткани необходимо предварительно обезводить, и только затем пропитывать. |
| Обезвоживание | Обезвоживание ткани производятся постепенно (чтобы не произошло сморщивания) путем проведения ее через спирты возрастающей крепости: 50º, 60º, 70º, 80º, 90º, 96º, 100º. В каждом спирте кусочки находятся от нескольких часов до 1 суток в зависимости от величины кусочка. |
| Уплотнение (заливка) | При заливке кусочки предварительно пропитываются теми жидкостями, которые служат растворителями для парафина (ксилол или толуол). При заливке в парафин кусочки из абсолютного спирта переносятся в смесь абсолютного спирта с хлороформом или ксилолом, взятых поровну, затем чистый ксилол и, наконец, в расплавленный насыщенный раствор парафина в хлороформе, где они находятся в термостате при температуре 37º до 1 суток и более. Дальнейшая заливка проводится в термостате при температуре 54º -56º в трех порциях парафина. Окончательная заливка проводится в парафин с добавлением воска, который наливают в специальные бумажные коробочки или стеклянные чашки, а затем эти коробочки или чашки после появления на поверхности парафина пленки, погружают в воду. Происходит полное затвердение парафина. Кусочки с окружающим их парафином извлекают из коробочек и с помощью расплавленного парафина, наклеивают на деревянные кубики, получаются парафиновые блоки. Уплотнения также можно добиться замораживанием кусочка органа (срочная биопсия). |
| Приготовление срезов | Срезы с блоков изготовляются на микротоме. Наиболее распространены микротомы санный и замораживающий. В специальных устройствах микротома зажимается парафиновый блок и микротомный нож. |
| Окрашивание | Перед окраской из парафиновых срезов обязательно удаляют парафин (растворением в ксилоле). Окрашивание необходимо производить для того, чтобы отчетливо выявить под микроскопом тонкие структуры объекта. По окрашиванию определенных гистологических структур различают краски ядерные (окрашивание ядра), цитоплазматические (окрашивающие цитоплазму), и специальные, окрашивающие избирательно определенные структуры. |
| Заключение среза | Окрашенные и промытые в воде срезы во избежание помутнения обезвоживают в спиртах (70º, 96º), просветляют в карбол-ксилоле, ксилоле, а затем на предметное стекло, где находится срез, помещают каплю бальзама и срез накрывают покровным стеклом. Бальзам представляет собой растворенную в ксилоле смолу одного из видов сосны, растущей в Канаде (канадский бальзам), смолу пихты (сибирский бальзам) или специальную синтетическую среду. При исследовании биопсий с целью уточнения диагноза в гистологических лабораториях прибегают к ускоренной обработке материала. Кусочки тканей и органов при этом проходят те же этапы обработки, но за 5-7 дней. Иногда производится так называемая срочная биопсия, когда в течение 15-80 мин. материал фиксирует, получают срезы, окрашивают их и заключают. Быструю фиксацию производят в 10% формалине, подогреваемом пламенем горелки или с использованием СВЧ-печи. Уплотнения добиваются замораживанием (хлорэтилом, углекислотой или с помощью замораживающего микротома). |
3.3. Основные гистологические красители и реакции (в столбце "результат" заполняется, в какой цвет окрашиваются красителями ядра, цитоплазма, включения, волокна и т.д.)
| Реагент | Результат |
| Гематоксилин | Окрашивает базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом. Базофильные структуры, как правило, это те, которые содержат нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК): клеточное ядро, рибосомы и РНК-богатые участки цитоплазмы. |
| Эозин | Окрашивает эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточные белки, например, тельца Леви. Цитоплазма является эозинофильной средой. Эритроциты всегда прокрашиваются ярко-красным цветом. |
| Орсеин | Используется для выявления эластиновых волокон, особенно это актуально в патологической анатомии кровеносных сосудов. Эластические волокна соединительной ткани окрашиваются в тёмно-красный цвет; остальные структуры - в слабо-розовый цвет. |
| Серебрение | Солями серебра используют для выявления нервных клеток, нейроглиальных элементов, периферических нервных волокон и их окончаний, ретикулярной стромы органов, межклеточного вещества эпителия и гладкой мускулатуры, бледных трепонем и др. С целью улучшения качества препаратов срезы после серебра нередко тонируют солями золота, окрашивание в фиолетовый цвет. |
| Железный гематоксилин | Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя. Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. |
| Реактив Шиффа | Позволяет выделить гликоген и гликопротеины (лиловый цвет). Соединительная ткань, хрящ, костная ткань, железистые клетки и структуры ткани почек окрашиваются в лиловый цвет. Ядро окрашивается в синий. |
| Романовский Гимза | Посредством данного метода окраске подлежат ацидофильные образования в разные оттенки красного цвета. Образования базофильного характера окрашиваются в цвет от пурпурного до синего. |
3.4.Заполните таблицу, перечислив основные группы красителей, укажите название структур, воспринимающих краситель, и примеры красителей
| Группы красителей | Название окрашиваемых структур | Пример красителя |
| Основные, или ядерные, красители | хроматин ядер, ядрышко | гематоксилин, тионин, кармин, метиловый зеленый |
| Кислотные красители | цитоплазматические структуры клеток, эритроциты | эозин, кислый фуксин, Конго красный (конгорот), эритрозин |
| Нейтральные красители | жиры и липоиды, ядра | судан III, судан IV, метиленовый синий |
4. Некоторые специальные методы приготовления и окрашивания препаратов (методика исследования биоматериала)
4.1. Практические задания. Напишите, как готовятся растворы, методику проведения реакции и результат.
Вариант 6. Окрашивание липидов суданом III.
Является наиболее распространенным методом выявления жира.
Приготовление раствора красителя.
В 100 мл горячего 70% спирта засыпают 0,2—0,3 г порошка судана III, несколько раз взбалтывают и ставят в термостат (при58°С) на несколько часов, затем охлаждают и фильтруют.
Метод.
1. Замороженные срезы (из свежей или фиксированной в формалине ткани) на несколько минут переносят из воды в 50% спирт.
2. Помещают в спиртовой раствор красителя на 15—30 мин (бюксы следует закрывать, так как испарение спирта приводит к выпадению осадков красителя).
3. Быстро ополаскивают в 50% спирте.
4. Промывают в дистиллированной воде.
5. Подкрашивают ядра кислым гемалауном.
6. Промывают и заключают в желатин или глицерин-желатин (обезвоживание в спиртах
экстрагирует жиры).
Результат.
Жировые вещества интенсивно оранжевого цвета, ядра —"синие. Препараты выцветают сравнительно скоро, поэтому откладывать исследование не рекомендуется.
Вариант 11. Методы исследования кожи и ее производных. Окраска азаном.
Окрашивание азаном по методу Гейденгайна – является модификацией метода Маллори, что позволяет получать более четкоеокрашивание соединительной ткани, чем основной метод. Данную методику хорошо использовать при окраске железистой и других тканей. Окраска срезов лучше удается после сулемовых фиксаторов (жидкость Ценкера и её модификация по Максимову), можно и после простой формалиновой фиксации материала.
Приготовление растворов:
1. Раствор азокармина – к 100мл дистиллированной воды добавляют 0,1 г азокармина. Затем в течение нескольких минут кипятят и после охлаждения профильтровывают. К фильтрату добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты.
2. Раствор анилинового синего и оранжевого G - к 100мл дистиллированной воды добавляют 0,5 г анилинового синего, 2,0 г оранжевого G. Смесь кипятят в течение 2-3 минут, охлаждают и профильтровывают. Перед употреблением раствор разводят в 2-3 раза дистиллированной водой.
3. Раствор анилинового спирта – в 100 мл 90% спирта растворяют 0,1 мл анилинового масла (практически удобнее 1,0 мл анилинового масла растворить в 1 л спирта).
4. Уксуснокислый спирт – к 100 мл 96% спирта добавляют 1 мл ледяной уксусной кислоты.
5. Раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты – 5 мг химически чистого препарата растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Окрашивание срезов проводят следующим образом:
1. Срезы переносят в раствор азокармина и помешают на 1,5- 2 часа в термостат с температурой 56-60 градусов. Срезы для этого помешают в хорошо закрывающиеся биологические стаканчики (или бюксы) с притертой пробкой.
2. Далее стаканчик со срезами охлаждают при комнатной температуре в течение 10-15 минут.
3. Срезы извлекают из стаканчиков (или бюкса), ополаскивают в дистиллированной воде.
4. Срезы переносят в раствор анилинового спирта и выдерживают до тех пор, пока не будут четко выявлены ядра (контроль под микроскопом). Если не удается долго выявить ядра, можно добавить в раствор дистиллированной воды, что ускорит процесс дифференцировки;
5. После дифференцировки ядер быстро промыть в течение 1-2 минуты уксуснокислым спиртом.
6. Протрава срезов в растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты в среднем в течении 1-3 часов в зависимости от выявления элементов соединительной ткани под контролем микроскопа.
7. Ополаскивание в дистиллированной воде и переносят в разведенный раствор анилинового синего и оранжевого G – в течение 2-3 часов, после чего быстро ополаскивают в дистиллированной воде и переносят в 96% спирт для дифференцировки.
Результаты: при правильной дифференцировке коллагеновые и ретикулиновые волокна окрашиваются в синий цвет при отсутствии общего голубого тона, ядра клеток - в красный цвет. Мышечная ткань – в различные оттенки красно-оранжевого цвета.
Вариант 21. Методы исследования соединительных тканей. Импрегнация ретикулярных волокон серебром по способу Фута.
Фиксация материала в 15—20%-ном растворе формалина. После фиксации промывание в проточной воде 24—48 часов, а затем несколько часов в дистиллированной. Срезы получают на замораживающем микротоме. Работать только с химически чистыми реактивами, посуда безукоризненно чистая, переносят срезы только стеклянными иголками.
Необходимые материалы
0,25%-ный водный раствор марганцевокислого калия.
5%-ный раствор щавелевой кислоты.
2%-ный раствор азотнокислого серебра.
Раствор аммиачного серебра: на каждые 5 мл 10%-ного раствора AgNO3 прибавляют 4—5 капель 40%-ного водного раствора (гидрата окиси аммония) NH4OH. Образуется осадок (темно-бурый) гидрата окиси серебра. Осадок растворяют 25%-ным нашатырным спиртом, добавляя его по каплям, хорошо взбалтывая. На 5 мл 10%-ного AgNO3 необходимо 15—25 капель 25%-ного NH4OH.
Гидрат окиси аммония.
5%-ный раствор формалина.
0,5—1%-ный раствор хлорного золота.
5%-ный водный раствор гипосульфита.
Дистиллированная вода.
Ход окраски
1.Замороженные срезы из дистиллированной воды переносят в 0,25%-ный водный раствор марганцевокислого калия на 5—10 мин.
2.Споласкивают в водопроводной воде.
3.Выдерживают в 5%-ном растворе щавелевой кислоты 15—30 мин (до побеления срезов).
4.Тщательно промывают (20—30 мин) в большом количестве дистиллированной воды.
5.Выдерживают в темноте 48 часов в 2%-ном растворе азотнокислого серебра (AgNO3).
6.Быстро (3—5 сек) споласкивают в дистиллированной воде.
7.Выдерживают 15—20 мин в свежеприготовленном и профильтрованном растворе аммиачного серебра.
8.Споласкивают в дистиллированной воде (5—15 сек, время выбирают эмпирическим путем).
9.Помещают в 5%-ный раствор формалина на 15—30 мин
10.Тщательно промывают в водопроводной воде.
11.Перекладывают в 0,5— 1%-ный раствор хлорного золота (АиС13) на 5—10 мин.
12.Промывают в водопроводной воде (10—15 мин).
13.Обрабатывают в 5%-ном водном растворе гипосульфита 1—3 мин. Контролируют под микроскопом, споласкивая в воде.
14. Тщательно промывают в водопроводной воде — от нескольких часов до суток.
Ядра клеток докрашивают квасцовым кармином или гематоксилином.
Проводят через спирт, карбол-ксилол и заключают в бальзам. Результаты окраски: ретикулярные волокна черные, коллагеновые волокна фиолетовые, коричневые или серовато-черные.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Комплект тестовых заданий
по производственной (специализированной) практикепо темам
модуля 1 – Цито- и гистологические методы исследования
Тестовые задания по технике безопасности при работе в гистологической лаборатории
Вопрос 6. Рабочая поверхность стола для лаборантов должна быть площадью не меньше:
- 100×30 см
- 50×50 см
- 120×60 см
- 200×100 см
- 140×80 см
Вопрос 11. В отделении следует провести ряд гистохимических исследований, а для фиксации кусочков ткани необходим нейтральный формалин, которого нет в отделении. Нейтрализация формалина производится с помощью добавления к нему:
- уксусной кислоты
- азотнокислого серебра
- углекислой магнезии
- медного купороса
- пикриновой кислоты
Вопрос 21. Начало формы
С какой целью под стеклом рабочего стола лаборанта должен находится белый лист бумаги размером 9×12 см:
- для создания соответствующего фона, облегчающего работу с окрашенными объектами
- для записи наиболее распространенных методик окраски
- для создания соответствующего фона, облегчающего работу с неокрашенными объектами
- для решения вопроса о качестве фиксации кусочка ткани
- для улучшения качества заливки кусочков ткани в парафин
Вопрос 31. При маркировке материала в растворе формалина, запись проводят с помощью:
- акварельных красок
- авторучки с красной пастой
- авторучки с синей пастой
- простого карандаша
- авторучки с черной пастой
Вопрос 41. Норма расхода спирта на один объект биопсии:
- 10 г
- 20 г
- 30 г
- 40 г
Тестовые задания по теме "Техника гистологического исследования"
1. Помещения для проведения гистологических исследований включают:
- комната для приёма и вырезки операционно-биопсийного материала;
- гистологическая лаборатория;
- фиксационная и моечная комнаты;
- комната для хранения гистологического архива.
2. Отметьте необходимые документы в патологоанатомическом отделении:
- протокол патологоанатомического вскрытия;
- бланки врачебного свидетельства о смерти;
- бланк-направление на гистологическое и цитологическое исследование;
- алфавитная книга операционного и биопсийного материала;
- журнал регистрации операционно-биопсийного материала.
3. Ответственность за правильность оформления врачебного свидетельства о смерти несёт:
- заведующий отделением;
- врач, подписавший свидетельство о смерти;
- лаборант, заполняющий свидетельство о смерти.
4. Сроки хранения влажного архива, блоков и стёкол в паталогоанатомическом отделении при часто встречающейся патологии:
- 1 год;
- 10 лет;
- пожизненно;
- 2 года;
- 6 месяцев.
10.При фиксации в кислом формалине в срезах может образоваться тёмно-коричневый пигмент в виде глыбок, который удаляют, помещая срезы в:
- 1-5% раствор аммиака;
- 70% спирт;
- 10% раствор лимонной кислоты.
11. Назовите фиксаторы, используемые для костной ткани:
- формалин;
- жидкость Карнуа;
- жидкость Буэна;
- жидкость Гелли (ценкер-формол);
- этиловый спирт.
12. Декальцинацию костного материала проводят в:
- азотной кислоте;
- трилоном Б;
- муравьиной кислоте;
- формалином;
- пикриновой кислоте.
13.Обезвоживание тканей возможно с помощью:
- этилового спирта восходящей концентрации;
- 99% изопропилового спирта;
- диоксана;
- глицерина.
| 20. Температура плавления твёрдого парафина: - 38-46ºС; - 56-58ºС; - 52-56ºС; - 68-76ºС. 21. Парафин растворяется в: - спирте; - хлороформе; - ксилоле; - соляной кислоте; - серной кислоте. 22. Эластичность парафину придаёт: - касторовое масло; - воск; - ксилол; - дибутилфталат; - вазелиновое масло. 23. Парафин и хлороформ для составления парафиновой каши берутся в соотношении: - 1:3; - 1:1; - 1:10; - 1:20; - 1:4. |
30. Срезы могут быть сморщенными, закручиваться из-за:
- недостаточного угла наклона ножа;
- загрязнения парафина;
- высокой температуры в помещении;
- низкой температуры в помещении;
- заливки материала в легкоплавкий парафин.
31.Если срезы сморщенные, закручиваются, нужно:
- увеличить угол наклона ножа;
- перед получением срезов поместить материал в холодильник;
- декальцинировать объект;
- перезалить в более тугоплавкий парафин;
- уменьшить угол наклона ножа.
31. Причина, прилипания среза к ножу:
- высокая температура в помещении;
- плохая пропитка материала;
- электризация.
33.Если срез прилипает к ножу, нужно:
- перед получением среза подышать на блок;
- перед получением среза поместить блок в холодильник;
- перезалить в более тугоплавкий парафин;
- сменить нож на хорошо заточенный.
40. Если при работе на замораживающем микротоме ткань крошится, нужно:
- ткань слегка подморозить;
- «подогреть» ткань пальцем;
- взять другой кусочек ткани из архива;
- поместить кусочек ткани в физиологический раствор.
41.Замороженные срезы хранят:
- в 5-12% формалине;
- в 70% спирте;
- в 96% спирте.
42. Критерий достаточной обработки срезов в ксилоле:
- потемнение кусочка;
- просветление кусочка;
- изменение цвета кусочка.
43.Назовите оптимальный угол наклона ножа в санном микротоме:
- 7-9 градусов;
- 13-15 градусов;
- 25-30 градусов.
65. Результат окраски гематоксилином-эозином:
- ядро красное, цитоплазма жёлтая;
- ядро синее, цитоплазма розовая;
- ядро и цитоплазма синие;
- ядро не окрашивается, цитоплазма голубая.
66. Методы определения полисахаридов:
- ШИК-реакция;
- окраска по Ван-Гизону;
- метод Беста;
- окраска гематоксилином и эозином;
- метод Шабадаша.
67.Метод выявления кислых глизаминогликанов:
- метод Хейла;
- метод Гриммелиуса;
- метод Оса;
- метод Фельгена;
- метод Браше.
68. Фуксиленом окрашиваются волокна:
- коллагеновые;
- ретикулярные;
- эластические.
69. Вещество, которое выявляется при помощи реакции Шабадаша:
- жиры;
- гликоген;
- белки;
- кальций;
- железо.
Ситуационные задачи по теме "Методы и техника микроскопии"
Задача 5. При изучении микропрепарата в световом микроскопе интересуемая структура находится у края поля зрения, справа. В какую сторону следует переместить микропрепарат на предметном столике микроскопа, чтобы она оказалась в центре поля зрения?
Ответ: влево.
Задача 7. Исследователю предстоит изучить структуры клетки размером меньше 0,2 мкм. Какие методы исследования нужно ему рекомендовать?
Ответ: ультрафиолетовую микроскопию (для рассмотрения доступны объекты размером 0,1 мкм), флюоресцентную (люминисцентную) микроскопию (для рассмотрения доступны объекты размером от 0,13 мкм(при использовании ближних УФ лучей) до 0,25 мкм( при использовании сине-фиолетовых лучей)).
ПРИЛОЖЕНИЕ 3