Ключевые эндогенные посредники апоптоза
Апоптоз является строго контролируемым на генетическом уровне и чрезвычайно эффективным процессом гибели клеток, который требует взаимодействия множества эндогенных посредников. Компоненты апоптотической сигнальной системы могут активироваться различными стимулами. Клетки погибают по типу классического апоптоза с соответствующими морфофункциональными изменениями при условии активации и участия каспаз - цистеинзависимых аспартатспецифичных протеаз (cysteine-dependent aspartate-specific proteases). Именно каспазы непосредственно повреждают несколько сотен молекулярных структур клетки, определяя специфику морфологических проявлений апоптоза на клеточном уровне. На основании структурно-функциональных особенностей каспаз их разделяют их на три группы, названия которых отражают их функциональные особенности:
· воспалительные (каспазы-1, -4, -5, -13, -14);
· инициаторные апоптотические (каспазы-2, -8, -9, -10);
· эффекторные апоптотические (каспазы-3, -6, -7).
У человека обнаружено двенадцать из четырнадцати известных представителей этого семейства. При активации каспаз происходят необратимые морфофункциональные изменения ядерного аппарата и цитоскелета, сопровождающиеся типичными биохимическими и структурно-функциональными изменениями на фоне отсутствия выраженных морфологических изменений мембран на начальной стадии процесса (см. рис. 6.1).
Рис. 6.1. Гетероспецифическая регуляция апоптоза
Рецепторно-опосредованная инициализация апоптоза осуществляется при активации рецепторов семейства TNFR (tumor necrosis factor receptor; рецептор к фактору некроза опухолей), которое включает более 20 представителей. Наиболее детально изучены механизмы развития апоптоза при активации рецепторов Fas (Apo-1/CD-95), TRAILR (DR4, DR5) и TNFR1 (LoweS.W. etal., 2000; AshkenaziA., 2002; IgneyF.H. etal., 2002; KarinM. etal., 2002).
Механизм Fas-опосредованного апоптоза играет ведущую роль в физиологической регуляции клеточной гибели. Комплекс, возникающий при связывании рецептора с лигандом (FasL), олигомеризуется и активирует адапторные белки, что приводит к образованию эффекторного сигнального комплекса DISC (deathinducedsignalingcomplex; летально индуциремый сигнальный комплекс), который содержит прокаспазу-8 или -10. Соответствующая прокаспаза посредством аутопротеолитического расщепления переходит в активную форму – каспазу – представителя апикального семейства протеолитических ферментов, инициирующих апоптоз. В зависимости от типа клеток, при участии каспаз-8/10 апоптоз может развиваться двумя путями.
В первом случае инициаторные каспазы непосредсвенно индуцируют протеолиз прокаспазы-3 с образованием эффекторного фермента, который непосредственно расщепляет различные клеточные белки, что сопровождается появлением характерных морфологических и биохимических признаков апоптоза. В клетках другого типа активированная инициаторная каспаза расщепляет белок Bid (представитель семейства Bcl-2) с последующей индукцией транслокации, олигомеризации и встраивания в наружную митохондриальную мембрану белка Bax. Это приводит к повышению проницаемости митохондриальных мембран и освобождению из митохондрий растворимых внутримембранных белков, инициирующих эффекторную стадию апоптоза (цитохром С, апоптоз-индуцирующий фактор). Данные белки участвуют в протеолитической активации каспазы-9, которая, в свою очередь, осуществляет расщепление и активацию эффекторных прокаспаз-3/7. Другой путь рецепторной инициализации апоптоза реализуется при участии TRAIL-рецепторов. Гиперэкспрессия рецепторов данного субсемейства, в которое входят рецепторы TRAIL-R1 (DR4) и TRAIL-R2 (DR5/Killer), характерна для трансформированных клеток и наблюдается на фоне подавления экспрессии Fas-рецептора. Развитие апоптоза в этом случае также осуществляется через активацию каспазы-8 и далее протекает аналогично Fas-индуцированным процессам.
Эндогенные механизмы инициализации апоптоза могут активироваться при действии различных внутриклеточных стрессорных факторов, включая как онкопротеины, прямое повреждение ДНК, гипоксию, нарушение спектра жизненно важных метаболитов. В качестве критического сенсора и ключевого регулятора внутриклеточных механизмов апоптоза выступает ген/белок р53. Так, например, сенсорные белки (АТМ, Сhk2), непосредственно воспринимающие повреждение ДНК, напрямую активируют р53 и инактивируют онкоген MDM-2 – ингибитор транскрипционной активности р53. Наличие онкогенов может вызывать активацию р53 с участием ARF (apoptosreleasingfactor), экспрессируемого геном р19. Белок р19ARF связывается с белком MDM-2 и инактивирует его, что сопровождается активацией р53.
Кроме того, белок p53 может инициировать программированную гибель клетки посредством транскрипционной активации проапоптотических белков представителей семейства Bcl-2 (Bax, Bak, Puma и NOXA) и ингибирования антиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-XL), а также белков-ингибиторов апоптоза (IAPs, inhibitorapoptosisproteins). Однако на этом функции р53 не исчерпываются. При его участии происходит трансактивация других генов, необходимых для апоптоза в том числе Аpaf-1, p21, Rb, RAS и генов, экспрессия которых приводит к повышению активности реактивных форм кислорода (ROS). Вдобавок р53 транскрипционно активирует экспрессию рецепторов CD95 и TRAIL, сенсибилизируя клетки к рецепторно-опосредованному механизму гибели.
Таким образом, при участии р53 транскрипционно активируются белки, регулирующие митохондриальные и рецепторные звенья апоптоза. Осуществляемая р53 регуляция активности белков семейства Bcl-2 влияет на соотношение процессов фосфорилирования и дефосфорилирования. Нарушения механизмов программированной гибели опухолевых клеток, возникающие вследствие трансформации их генетического аппарата, как правило, носят полиморфный характер и затрагивают практически все звенья – рецепторный аппарат, митохондриальные механизмы и эффекторное звено, представленное каспазами.
Апоптоз и онкогенез
По своей биологической сути онкогенез – это результат генетических нарушений, приводящих к неконтролируемому размножению поврежденной клетки. Многие молекулярно-генетические изменения, идентифицируемые как звенья онкогенеза, представляют собой нарушения регуляторных механизмов апоптоза. Преодолев генетически детерминированный контроль инициации программированной гибели, популяции злокачественных клеток экстенсивно развиваются, пополняясь гомологами с дополнительными мутациями, обладающими повышенной резистентностью к эндогенным и экзогенным факторам гибели, в том числе и химиотерапевтическим агентам.
Точная природа комбинации генетических изменений, необходимых для злокачественной трансформации клетки, не установлена. Является ли процесс следствием мутаций ключевых регуляторных генов или происходит в результате накопления последствий ряда мутагенных событий, зависит от индивидуального клеточного контекста. Вне зависимости от ведущего механизма превышение допустимого порога трансформации сопровождается утратой компенсаторных механизмов репарации генетических нарушений и способности к инициализации апоптоза, а клетка приобретает злокачественный фенотип.Последнее свойство является, пожалуй, наиболее важным при рассмотрении роли нарушений регуляторных механизмов апоптоза в онкогенезе. В интактной клетке индукция апоптоза может происходить как при дефиците сигналов сохранения, так и в результате действия проапоптотических эффекторов. Начальные стадии онкогенеза связаны с изменением баланса между активностью апоптотического аппарата и механизмами, ответственными за сохранение клетки.
Для приобретения клетками «полноценного» злокачественного фенотипа существует два взаимодополняющих пути повышения резистентности к апоптозу: увеличение восприимчивости к ростовым сигналам и накопление мутаций в генах, ответственных за реализацию программы гибели. Роль обоих механизмов определяется не только клеточным контекстом, но и состоянием регуляторных процессов на органно-тканевом и системном уровнях.
Собственно, нарушения апоптотического аппарата преимущественно связаны с дизрегуляцией различных звеньев внутриклеточных путей передачи сигналов, среди которых особое внимание отводится «хранителю генома» гену p53. Этот ген-супрессор опухолей наиболее часто (до 70% случаев) подвержен мутациям при различных злокачественных новообразованиях. Функциональные мутации или нарушения экспрессии p53 сопровождаются расстройствами активности нисходящих индукторов апоптоза Bax, Bak, Apaf-1 и др., а также его апикальных регуляторов Chk2, MDM2, р19ARF. Ген p53 транскрипционно активирует экспрессию рецепторов FasR и TRAILR, регулируя при этом рецепторно-опосредованную индукцию программированной гибели клеток. В то же время присутствие в опухолевых клетках нормального аллеля p53 зачастую не свидетельствует о функциональной полноценности путей регуляции апоптоза, так как онкогенез характеризуется полиморфными нарушениями в различных звеньях апоптотического аппарата, которые не обязательно напрямую сопряжёны с активностью белка p53. Нарушения апоптотических процессов в онкогенезе связаны с одним эффектом - подавление инициации апоптоза на фоне ускоренной пролиферации клеток и повышение их резистентности к химиотерапии (см. табл. 6.3).
Таблица 6.3. Некоторые нарушения звеньев апоптоза
при злокачественных новообразованиях
| Ген/белок | Характер нарушения | Патогенетическая значимость |
| p53 | Мутация (около 70% опухолей) или нарушение экспрессии | Нарушение внутренних апоптотических путей. Мутация или нарушение экспрессии сопровождается резистентностью к лекарственно-индуцируемому апоптозу |
| FasR | Мутация или снижение экспрессии в лимфоидных и солидных опухолях | Нарушение инициации рецепторно-опосредованного апоптоза,повышение резистентности к химиотерапии |
| DR4, DR5 | Мутации при метастазирующих опухолях молочной железы | Подавление инициации апоптоза, опосредованного через рецепторы смерти |
| Проапоптотические митохондриальные Bax, Bad | Мутация или снижение экспрессии в некоторых опухолях | Нарушения митохондриально-опосредованного этапа апоптоза. Возможна повышенная устойчивость к химиотерапии |
| Антиапоптотический митохондриальный Bcl-2 | Гиперэкспрессия часто встречается в различных опухолях | Ингибирует повышение проницаемости митохондриальных мембран, делая клетки устойчивыми к лекарственно-индуцированному апоптозу. Гиперэкспрессия связана с неблагоприятным прогнозом |
| Цитохром C | Нарушение высвобождения из митохондрий, коррелирующее со способностью к связыванию кальция | Повышение резистентности к апоптозу |
| Каспаза-9 | Снижение количества в апоптосомных комплексах | Дисфункции в активации апоптосом |
| Каспаза-8 | Гиперметилирова-ние гена или мутации в некоторых опухолевых клетках | Нарушения рецепторной и внутриклеточной инициации апоптоза. Ингибирование гена обусловливает устойчивость к лекарственно-индуцированному апоптозу |
| Каспаза-3 | Отсутствие ядерной транслокации в опухолевых клетках легких | Повышение устойчивости организма к лучевой терапии |
В трансформированных клетках на фоне нарушений апоптотического аппарата макроаутофагия является резервным механизмом программированной гибели и выступает в качестве альтернативного варианта или промежуточного процесса на пути развития некроза. В популяции клеток достаточно однородных солидных опухолей происходит комбинированная гибель клеток по различным механизмам со спонтанной активацией как апоптоза, так и некроза, что является причиной появления или усиления воспалительных реакций. При лучевой терапии воздействие ионизирующего излучения приводит к изменению соотношения апоптотических и некротических процессов на периферии и особенно в центре опухоли.
Таким образом, онкогенез неразрывно связан с разнообразными нарушениями различных звеньев апоптоза, что проявляется не только в особенностях молекулярных механизмов гибели различных популяций трансформированных клеток, но и в изменении перекрёстной регуляции между различными типами гибели – апоптозом, аутофагией и некрозом.