Агрегация тромбоцитов: спонтанная, с коллагеном, АДФ, ристоцетином (ристомицин)

Агрегация тромбоцитов - показатель в оценке нарушений в сосудисто-тромбоцитарной фазе гемостаза.

После повреждения сосуда тромбоциты скапливаются в месте повреждения, возникает реакция, завершающаяся активацией фосфолипазы. В результате мембрана клетки изменяет свойства и может вступать в контакт с соседними клетками. Вследствие этого тромбоциты могут агрегировать друг с другом и образовывать тромбоцитарный тромб.

Наиболее распространенные способы оценки агрегации тромбоцитов заключаются в исследовании скорости и степени уменьшения оптической плотности (увеличения светопропускающей способности) тромбоцитарной плазмы при перемешивании с индукторами агрегации (при изучении спонтанной агрегации они не добавляются) [68].

Для диагностически подавляющего большинства наследственных и приобретенных тромбоцитопатий достаточно исследования функциональных параметров тромбоцитов с использованием трех агонистов. Ими являются индукторы коллаген, ристоцетин и АДФ, входящие в набор АГРенам, предлагаемый НПО РЕНАМ [7].

1. Аденозин-5'-дифосфат динатриевая соль (АДФ), лиофильновысу-шенная с буфером и стабилизаторами из раствора с концентрацией .0.2 мМ/литр.

2. Коллаген из кожи теленка, выделенный методом кислотной экстракции, растворимый, тип III, лиофильновысушенный с буфером и стабилизаторами из раствора с концентрацией 0.2%.

3. Ристоцетин, гликопептидный антибиотик, выделенный из Nocardia lurida с молекулярной массой около 4 кД, лиофильновысушенный с буфером и стабилизаторами из раствора с концентрацией 1.5%.

СОСТАВ НАБОРА РЕАГЕНТОВ АГРЕНАМ:

0.2 мМ раствор АДФ (0.5 мл) -1 флакон;

0.2% раствор коллагена (0.5 мл) - 1 флакон;

1.5% раствор ристоцетина (0.5 мл) -1 флакон.

Все исследования проводятся в пластиковых пробирках или в стеклянных силиконизированных.

Определение результатов производилось при помощи двухканального агрегометра SOLAR AP 2110.

Магний эритроцитов

Магний - один из основных биологически активных элементов, необходимых для нормального функционирования нервной и мышечной систем.

Магний, как и калий, содержится преимущественно внутри клеток - в эритроцитах, мышцах, печени и других тканях. 1/3 - 1/2 всего магния организма содержится в костной ткани. Около 1% от всего количества магния организма находится во внеклеточной жидкости и плазме (в связанной с белками, комплексированной с неорганическими анионами и свободной форме). Его ионы являются активаторами большого числа ферментных систем, поэтому многие процессы жизнедеятельности клеток являются магний-зависимыми. Магний участвует в гликолизе, окислительном метаболизме, переносе натрия, калия и кальция через мембраны клеток и нервно-мышечной передаче импульсов, синтезе нуклеиновых кислот и других процессах. Уровень магния в сыворотке может сохраняться в нормальных границах, даже при снижении общего количества магния в организме на 80% [58].

Концентрация магния в эритроцитах определялась по цветной реакции с титановым желтым.

Принцип метода. Магний в щелочной среде образует комплекс красного цвета с титановым желтым, присутствие гидроксиламина стабилизирует окраску. При анализе сыворотки или эритроцитов белки осаждают вольфраматом натрия, моча предварительно разводится до нужной концентрации.

Используемые реактивы

1. 0,075%-ный раствор титанового желтого: 18,7 мг вещества растворяют в 25 мл воды, хранят в холодильнике в темной склянке (реактив очень светочувствителен, годен не более 10 дней).

2. 2%-ный раствор гидрохлорида гидроксиламина: 2 г гидроксиламинагидрохлорида (H2NOH ґ HCl) растворяют в 100 мл воды.

3. 0,1%-ный раствор метилового красного в 95%-ном этиловом спирте (индикатор с зоной перехода рН 4,4—6,2).

4. 0,2 н NaOH.

5. 1,5 н NaOH.

6. 10%-ный раствор вольфрамовокислого натрия: 10 г вольфрамата натрия (Na2WO4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.

7. 0,67 н серная кислота.

8. Калибровочный раствор магния сульфата 1 ммоль/л: 246,5 мг сульфата магния (MgSO4/7H2O) растворяют в воде, объем доводят в мерной колбе до 1 л.

При определении содержания магния в эритроцитах 0,5 мл эритроцитарной взвеси вносят в 2,5 мл воды, через несколько минут, когда взвесь просветлеет (станет лаковой), что свидетельствует о завершении гемолиза, добавляют 1 мл 10%-ного вольфрамата натрия, затем 1 мл 0,67 н серной кислоты. Перемешивают стеклянной палочкой, а затем через 10—15 мин центрифугируют или фильтруют. В градуированную пробирку или мерный цилиндр с отметкой 10 мл отмеривают 2,5 мл безбелкового фильтрата, добавляют каплю индикатора метилового красного и 0,2 н NaOH до установления желтой окраски. После этого прибавляют 1 мл 2%-ного гидрохлорида гидроксиламина, 1 мл 0,075%-ного титанового желтого и 2 мл 1,5 н NaOH и доводят объем водой до 10 мл. Фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны 500—560 нм против холостого опыта, в котором вместо эритроцитарной взвеси берут 1 мл воды [75].