Наука (и искусство) картирования микробиома

Если то, что вы слышали или читали о микробиоме, кажется вам слишком специальным или слишком противоречивым, то это потому, что микробиом и в самом деле не бином Ньютона. Он гораздо сложнее.

Причем одна из самых сложных задач – понять, а с чем, собственно говоря, мы имеем дело.

С точки зрения ДНК все люди, в сущности, одинаковы[141]. Но на микробном уровне наши сходства быстро превращаются в различия. В одном и том же органе или части тела двух человек часто содержатся совершенно разные микробные сообщества (и даже если общие виды имеются, то их количество и соотношение существенно разнятся). Возьмите любых двух человек и исследуйте по одной микробной клетке из стула каждого из них. Только в одном случае из десяти окажется, что обе клетки относятся к одному и тому же виду[142]. В то же время если вы сопоставите геномы этих же двух человек, то они совпадут на 99,9 %. Геном наших микробов не только гораздо разнообразнее, чем наш собственный, но и типы микроорганизмов у разных людей очень различаются.

На этом месте вы можете спросить: а откуда вы знаете, что наши микробы такие разные? Микроб – он и есть микроб. Lactobacillus – всегда Lactobacillus . Оказывается, не всегда.

Количество разновидностей микробов, которые удается обнаружить, зависит от способа исследования. Для определения разнообразия недостаточно простого подсчета отдельных видов. Дело в том, что количество видов, которые мы можем найти, тоже зависит от того, насколько старательно и тщательно мы ищем. Представьте себе, что вам нужно посчитать, сколько и каких именно рыб плавает в пруду. Если вам удалось выловить трех рыбок, это еще не дает вам оснований предполагать, что это и есть все население пруда. Если эти три рыбы – две форели и окунь, это еще не означает, что в пруду водятся только форели и окуни и что их соотношение непременно составляет два к одному. Ваш улов зависит от того, когда и как вы ловите и сколько раз вы забрасываете удочку или сеть.

Дело еще больше усложняется, когда мы пытаемся дать определение, что именно считать уникальным видом микроорганизмов. Когда речь идет о животных, это сравнительно легко: если два животных могут скрещиваться и давать способное к размножению потомство, то они по определению принадлежат к одному виду. Но микроорганизмы редко размножаются половым путем.

А когда это случается, то они могут обмениваться генетическим материалом не только между видами, но и еще гораздо шире: например, бактерии умеют скрещиваться и с другими бактериями, и с археями – и даже с эукариотами и вирусами. Это как если бы рыба могла скрещиваться с водорослями или с водомерками – насекомыми, живущими на поверхности воды! Тем не менее у бактерий нечто подобное происходит.

Есть еще одна проблема: очень немногие микроорганизмы готовы расти в лаборатории. Однако именно это требуется, чтобы вид получил официальное название и описание. Возвращаясь к рыбной аналогии: это все равно что выудить редкостную глубоководную рыбину, которая раздувается и лопается, прежде чем вы успеваете доплыть до берега и идентифицировать ее вид.

Правда, есть обходной путь. Пусть мы не можем вырастить многих микробов в лаборатории, но мы все равно можем выделить и проанализировать их ДНК и на основании этого решить, содержит ли их геном достаточно отличий, чтобы считаться отдельным видом. Мы также можем полностью отказаться от концепции вида и оценивать разнообразие по филогенетическому дереву – аналогу древа жизни, придуманному Дарвином и усовершенствованному Вёзе и Фоксом (см. стр. 8–9); микробное сообщество, которое занимает большую часть дерева, считается более разнообразным. Это полезный подход, потому что он позволяет назвать пруд, в котором обнаружено три вида форели, менее разнообразным, чем тот, в котором водятся форель, окунь и пескарь.

Наконец, вы должны решить, интересует ли вас только общее число видов, или вы хотите узнать, сколько особей каждого вида имеется в наличии в данной системе, и таким образом оценить количественное соотношение популяций. Почему это важно? Потому что если вы будете учитывать только количество видов, то пруд, в котором плавают одна форель, один окунь и тысяча пескарей, будет считаться таким же разнообразным, как тот, где насчитывается только по одному представителю каждого вида. В зависимости от того, какой аспект существования экосистемы вы рассматриваете, этого может быть и достаточно. Но в некоторых случаях – нет. Определяя, что считать разнообразием в конкретной экосистеме, приходится принимать множество решений.

Далее, вы можете захотеть сравнить между собой две экосистемы – два разных микробных сообщества. Для этого микробиологи используют метод уникального (индивидуального) фракционирования, или UniFrac[143], который позволяет изучить историю эволюционных изменений, разделивших эти два сообщества.

Кэти Лозьюпоун, одна из моих первых студенток, а ныне профессор медицинской школы Аншуц при Университете Колорадо, разработала этот метод и очень элегантно изложила его в своей докторской диссертации. Вначале мы наносим микробное сообщество на филогенетическое древо. Затем, используя статистический метод анализа главных компонент, вычисляем количество возможных вариантов отличия одних микробных сообществ от других.

Если вам это кажется китайской грамотой – или вы слишком давно изучали линейную алгебру (если вообще изучали), – не пугайтесь. Существуют компьютерные алгоритмы, которые делают эти вычисления за нас. Главное, что этот метод позволяет получить точную карту связей между микробными сообществами и выявить похожие сообщества, соседствующие на древе жизни.

Имея эту информацию, мы можем связать микробиом с конкретными заболеваниями. Чаще всего мы используем для этого кросс-секционный анализ: отбираем группу больных и группу здоровых людей и затем сравниваем их микробиомы. Кросс-секционные исследования позволили установить связь между кишечными микробами у людей и ожирением[144][145]диабетом первого[146][147][148]и второго[149][150][151][152]типов, воспалительными заболеваниями кишечника[153][154][155][156], синдромом раздраженного кишечника[157], раком толстого кишечника[158][159][160][161][162], заболеваниями сердца[163][164], ревматоидным артритом[165]и целым рядом других расстройств. Кросс-секционные исследования очень информативны, потому что когда мы выявляем значительные отличия между больной и здоровой группами, то понимаем, что за этим что-то кроется. Чтобы выяснить, действительно ли различные микроорганизмы вызывают определенные заболевания, необходимы дополнительные исследования.

“Золотой стандарт” кросс-секционных исследований – построение прогностической модели. Используя такую модель, можно взять данные некоторой выборки людей – больных или здоровых – и предсказать, больна или здорова остальная часть группы. Что и было успешно проделано для диабета[166][167], ожирения[168], воспалительных заболеваний кишечника[169]. Интересно, что конкретные биомаркеры (виды микроорганизмов или гены, связанные с болезнью) в разных популяциях отличаются, например шведские от китайских при диабете второго типа. Таким образом, было бы преждевременно связывать определенные организмы с определенными болезнями на основании того, что мы узнали из кросс-секционных исследований, потому что то, что мы считаем патогеном, в разных популяциях может варьироваться.

Уникальность проекта “Микробиом человека” состоит в том, что он направлен в большей степени на здоровых, чем на больных. Проект позволил выявить, что на удивление большое количество тщательно проверенных здоровых добровольцев – до 30 процентов – являлись носителями микробов, которые считаются опасными патогенами, в том числе Staphylococcus aureus – золотистого стафилококка. Эти люди были, без сомнения, здоровы, что заставляет предположить, что многие из нас являются носителями организмов, которые вызывают болезнь только при определенных условиях. Вспомните о сорняках: они представляют проблему, только если растут там, где не должны расти. И это подсказывает нам, что, может быть, стоит переключиться с вопроса “Какие микробы “плохие”, как избежать контакта с ними или избавиться от них?” на вопрос “Почему одни и те же микробы безвредны для одних людей, но смертельно опасны для других?”.

Получив некоторое представление о том, какие микробы могут быть связаны с теми или иными заболеваниями, мы можем планировать длительное (его еще называют динамическим или продольным – в отличие от кросс-секционного, то есть поперечного) исследование. В ходе подобного исследования мы наблюдаем за одними и теми же людьми в течение долгого времени. Исследователи используют длительные исследования, когда хотят изучить слабые влияния, которые вызывают изменения микробиома у одних людей и в то же время совершенно не влияют на других. На сегодняшний день существует на удивление мало динамических исследований микробиома. Тем не менее мы рассчитываем, что их количество будет возрастать по мере дальнейшего снижения стоимости секвенирования ДНК.

“Золотой стандарт” динамического исследования – это перспективный когортный метод. Он состоит в том, что для участия привлекаются люди либо здоровые, либо еще не начавшие лечиться (в противном случае исследование называется интервенционным). Вы спросите: разве можно предсказать, кто из них заболеет и на кого подействует лечение? На момент написания этих строк ни одно из этих исследований не было достаточно обширным, чтобы получить окончательные выводы, хотя проект TEDDY (изучающий факторы окружающей среды, которые определяют диабет первого типа у молодых) в настоящее время обрабатывает данные о тысячах детей с риском развития диабета[170].

Перспективные когортные исследования, особенно долговременные, помогают выяснить, создает ли определенный микробиом угрозу развития болезни и подействует ли лечение на конкретного больного.

Существует еще один вид исследований – изучение механизмов. Подобные исследования обычно проводятся на мышах (по причинам, которые сейчас станут понятны) и позволяют нам выяснить, как именно работает конкретный биохимический механизм. Обычная методика такова: мы изменяем гены мышей; вводим им препарат, который, как мы считаем, будет иметь определенный эффект; добавляем или удаляем бактерии; проверяем и анализируем последствия. К сожалению, необходимое условие этого метода – умерщвление мышей с последующим исследованием их внутренних органов.

Одна из наиболее успешных и информативных методик изучения механизма состоит в том, что мышей выращивают в стерильном боксе, где нет никаких микробов. Затем им можно ввести определенные микробы и проследить за изменениями. Благодаря этим так называемым гнотобиологическим мышам (от греческого слова “гносео” – “знать”, потому что мы точно знаем, какие микроорганизмы с ними взаимодействовали) мы узнали, какие микроорганизмы влияют на ожирение, демиелинизацию нейронов (эродирование защитной оболочки нервов) при рассеянном склерозе[171][172], а также вызывают поведенческие расстройства, напоминающие аутизм[173]. Правда, никогда не нужно забывать, что то, что действует на мышей, необязательно действует на людей. Тем не менее эксперименты на мышах все равно дают нам бесценную информацию.

Многое из того, что вы слышите о микробиоме и болезнях, может показаться вам запутанным, противоречивым, а иногда и преувеличенным. Чему верить? Стараясь разобраться, действительно ли микробы могут вылечить ту или иную болезнь, ищите положительные результаты, сопоставляя многие исследования, особенно такие, где проблема рассматривалась под разными углами. Результаты таких исследований с большей вероятностью окажутся правдивыми, так же как и результаты исследований с большим числом участников. В целом можно сказать, что пока у нас есть скорее корреляция между определенными микробами и определенными болезнями, подкрепленная пониманием предполагаемых механизмов (чаще всего эти результаты получены на мышах), а не четкая причинно-следственная связь.

Кроме того, результаты исследования в огромной степени зависят от методики его проведения. Например, если мы изучаем синдром раздраженного кишечника, в достаточной ли мере мы сузили круг участников? Мы ищем только больных СРК, страдающих от газов? Или от боли? Или тех, кто болезненно реагирует на определенные продукты? В случае изучения ожирения мы должны поинтересоваться резистентностью наблюдаемых к инсулину, тем, как именно жир распределяется на теле, и так далее.

Другие факторы, которые нужно принимать во внимание при сравнении результатов разных исследований: методы хранения проб; методы экстракции ДНК из образцов кала; какие именно фрагменты генома рассматриваются для идентификации; какой именно аппарат используется для секвенирования ДНК; какое программное обеспечение используется для анализа данных, и даже точные установки этих программ[174][175][176][177]. Чтобы не упустить возможные слабые влияния, необходимы высокие стандарты методов.

Если все это звучит сложно, то это потому, что микробиом – сложная штука. И поэтому его исследование требует вдумчивого и взвешенного подхода. Об этой сложности стоит вспоминать всякий раз, когда вы слышите головокружительные заявления по поводу микробиома или вам предлагают простые решения по его улучшению и исправлению. В таких случаях не забывайте спрашивать: а кто это утверждает и откуда он или она это знает?

В конце концов, вы же не станете доверять ученому-ракетчику, обещавшему доставить вас на Марс, если он даже не сможет сказать вам, на каком расстоянии находится Красная планета!

 

Благодарности

Я хотел бы выразить признательность многим сотрудникам моей лаборатории, среди которых Дэниел Макдональд, Джастин Дебелиус, Джессика Меткалф, Эмбриетт Хайд, Люк Урселла, Амнон Амир, Уилл Ван Треурен и Дана Уиллнер; своим коллегам по микробиомным проектам, в том числе Джайрам Ванамала, Марти Блейзеру, Марии Глории Домингес-Белло, Эду Йонгу, Рут Лей, Саркизу Мазманьяну, Дэну Найту, Греуг Капорасо, Джеку Гилберту, Оуэну Уайту, Питеру Дорештейну, Николаусу Корреллу, Аджай Шатрия, Андреа Эдвардсу и Дон Филд.

Мои родители Эллисон и Джон Найт, моя подруга Аманда Бирмингем также внесли ценный вклад в эту книгу и особенно в события, участниками которых они стали, и я отдельно хотел бы поблагодарить Аманду и нашу дочь Элис за их терпение и поддержку. Мои коучи из программы TED Майкл Вайц и Абигейл Тененбаум очень помогли мне при подготовке лекции и этой книги. Их взгляд со стороны оказался очень полезен. Они, а также Крис Андерсон, Джун Коэн и остальные участники команды TED действительно научили меня по-новому общаться с публикой.

Мишель Квинт, Майкл Бехар и Грейс Рубинштейн помогли книге преодолеть финишную черту. Меня вдохновляли мои примерно 800 коллег (если верить моему списку “Возможные конфликты интересов” в Национальном научном фонде), особенно Джеффри Гордон, студенты и сотрудники лаборатории, коллеги по BioFrontiers в Боулдере, которые создавали мне щадящие условия в работе по другим проектам, пока я писал эту книгу.

В финансировании наших работ участвовали такие организации, как Медицинский институт Говарда Хьюза, Национальные институты здравоохранения (включая проект “Микробиом человека”), Национальный научный фонд, Министерство энергетики США, Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства (НАСА), Национальный институт юстиции (НИЮ), американо-израильский Межнациональный научный фонд, фонды В. М. Кека, Альфреда П. Слоуна, Джона Темплтона, Джейн и Чарли Батчер, Колорадский центр биотоплива и биоресурсов, Американский фонд борьбы с болезнью Крона и колитом, фонды Билла и Мелинды Гейтс, Гордона и Бетти Мур, а также тысячи представителей общественности.

Все ошибки и неточности, конечно, на моей совести, хотя в написании книги активное участие принимал Брендон.

 

[1]Следует отметить, что последний доклад Американской академии микробиологии снижает это соотношение до 3:1 в основном за счет увеличения числа подсчитанных клеток человека. Но в любом случае численный перевес на стороне микробов. См.: http://academy.asm.org/index.php/faq-series/5122humanmicrobiome.

 

[2]Доступно онлайн: проект “Гутенберг”, www.gutenberg.org/files/1228/1228-h/1228-h.htm.

 

[3]N. O. Verhulst et al., “Composition of Human Skin Microbiota Affects Attractiveness to Malaria Mosquitoes,” PloS One 6, no. 12 (2011): e28991.

 

[4]E. A. Grice et al., “Topographical and Temporal Diversity of the Human Skin Microbiome,” Science 324, no. 5931 (May 29, 2009): 1190–92; E. K. Costello et al., “Bacterial Community Variation in Human Body Habitats Across Space and Time,” Science 326, no. 5960 (December 18, 2009): 1694–97.

 

[5]F. R. Blattner et al., “The Complete Genome Sequence of Escherichia Coli K-12,” Science 277, no. 5331 (September 5, 1997): 1453–62.

 

[6]R. H. MacArthur and E. O. Wil-son, The Theory of Island Biogeography . Princeton, NJ: Princeton University Press, 2001.

 

[7]N. Fierer et al., “Forensic Identification Using Skin Bacterial Communities,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, no. 14 (April 6, 2010): 6477–81.

 

[8]“Место преступления: Майами”: “CSI: Miami Season 9,” Wikipedia, http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_CSI:_Miami_episodes#Season_9:_2010.E2.80.932011.

 

[9]Для очень познавательного и развлекательного введения в “сад нашего тела” см.: Mary Roach, Stiff: The Curious Lives of Human Cadavers . New York: W. W. Norton, 2004.

 

[10]Meagan B. Gallagher, Sonia Sandhu, and Robert Kimsey, “Variation in Developmental Time for Geographically Distinct Populations of the Common Green Bottle Fly, Lucilia sericata (Meigen),” Journal of Forensic Sciences 55, no. 2 (March 2010): 438–42.

 

[11]O. S. Von Ehrenstein et al., “Reduced Risk of Hay Fever and Asthma Among Children of Farmers,” Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 30, no. 2 (February 2000): 187–93; E. von Mutius and D. Vercelli, “Farm Living: Effects on Childhood Asthma and Allergy,” Nature Reviews Immunology 10, no. 12 (December 2010): 861–68.

 

[12]E. S. Charlson et al., “Assessing Bacterial Populations in the Lung by Replicate Analysis of Samples from the Upper and Lower Respiratory Tracts,” PloS One 7, no. 9 (2012): e42786; E. S. Charlson et al., “Topographical Continuity of Bacterial Populations in the Healthy Human Respiratory Tract,” American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 184, no. 8 (October 15, 2011): 957–63.

 

[13]J. K. Harris et al., “Molecular Identification of Bacteria in Bronchoalveolar Lavage Fluid from Children with Cystic Fibrosis,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, no. 51 (December 18, 2007): 20529–33.

 

[14]E. S. Charlson et al., “Topographical Continuity of Bacterial Populations in the Healthy Human Respiratory Tract,” American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 184, no. 8 (October 15, 2011): 957–63.

 

[15]A. Morris et al., “Comparison of the Respiratory Microbiome in Healthy Nonsmokers and Smokers,” American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 187, no. 10 (May 15, 2013): 1067–75.

 

[16]O. E. Cornejo et al., “Evolutionary and Population Genomics of the Cavity Causing Bacteria Streptococcus Mutans,” Molecular Biology and Evolution 30, no. 4 (April 2013): 881–93.

 

[17]J. Slots, “The Predominant Cultivable Microflora of Advanced Periodontitis,” Scandinavian Journal of Dental Research 85, no. 2 (January/February 1977): 114–21.

 

[18]M. Castellarin et al., “Fusobacterium Nucleatum Infection Is Prevalent in Human Colorectal Carcinoma,” Genome Research 22, no. 2 (February 2012): 299–306; M. R. Rubinstein et al., “Fusobacterium Nucleatum Promotes Colorectal Carcinogenesis by Modulating E-Cadherin/BetaCatenin Signaling via Its FadA Adhesin,” Cell Host & Microbe 14, no. 2 (August 14, 2013): 195–206; A. D. Kostic et al., “Fusobacterium Nucleatum Potentiates Intestinal Tumorigenesis and Modulates the Tumor-Immune Microenvironment,” Cell Host & Microbe 14 (2013): 207–15; R. L. Warren et al., “Co-occurrence of Anaerobic Bacteria in Colorectal Carcinomas,” Microbiome 1, no. 1 (May 15, 2013): 16; L. Flanagan et al., “Fusobacterium Nucleatum Associates with Stages of Colorectal Neoplasia Development, Colorectal Cancer and Disease Outcome,” European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases: Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology 33, no. 8 (August 2014): 1381–90.

 

[19]D. Falush et al., “Traces of Human Migrations in Helicobacter Pylori Populations,” Science 299, no. 5612 (March 7, 2003): 1582–85.

 

[20]P. B. Eckburg et al., “Diversity of the Human Intestinal Microbial Flora,” Science 308, no. 5728 (June 10, 2005): 1635–38.

 

[21]M. Hamady and R. Knight, “Microbial Community Profiling for Human Microbiome Projects: Tools, Techniques, and Challenges,” Genome Research 19, no. 7 (July 2009): 1141–52.

 

[22]Human Microbiome Project Consortium, “Structure, Function and Diversity of the Healthy Human Microbiome,” Nature 486, no. 7402 (June 13, 2012): 207–14.

 

[23]Eckburg et al., “Diversity of the Human Intestinal Microbial Flora,” 1635–38.

 

[24]R. E. Ley et al., “Microbial Ecology: Human Gut Microbes Associated with Obesity,” Nature 444, no. 7122 (December 21, 2006): 1022–23; P. J. Turnbaugh et al., “A Core Gut Microbiome in Obese and Lean Twins,” Nature 457, no. 7228 (January 22, 2009): 480–84; J. Henao-Mejia et al., “Inflammasome-Mediated Dysbiosis Regulates Progression of NAFLD and Obesity,” Nature 482, no. 7384 (February 1, 2012): 179–85; V. K. Ridaura et al., “Gut Microbiota from Twins Discordant for Obesity Modulate Metabolism in Mice,” Science 341, no. 6150 (September 6, 2013): 1241214; M. L. Zupancic et al., “Analysis of the Gut Microbiota in the Old Order Amish and Its Relation to the Metabolic Syndrome,” PloS One 7, no. 8 (2012): e43052; D. Knights et al., “HumanAssociated Microbial Signatures: Examining Their Predictive Value,” Cell Host & Microbe 10, no. 4 (October 20, 2011): 292–96; E. Le Chatelier et al., “Richness of Human Gut Microbiome Correlates with Metabolic Markers,” Nature 500, no. 7464 (August 29, 2013): 541–46; A. Cotillard et al., “Dietary Intervention Impact on Gut Microbial Gene Richness,” Nature 500, no. 7464 (August 29, 2013): 585–88.

 

[25]R. A. Koeth et al., “Intestinal Microbiota Metabolism of L–Carnitine, a Nutrient in Red Meat, Promotes Atherosclerosis,” Nature Medicine 19, no. 5 (May 2013): 576–85; W. H. Tang et al., “Intestinal Microbial Metabolism of Phosphatidylcholine and Cardiovascular Risk,” New England Journal of Medicine 368, no. 17 (April 25, 2013): 1575–84.

 

[26]Y. K. Lee et al., “Proinflammatory T-cell Responses to Gut Microbiota Promote Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,” supplement 1, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (March 15, 2011): 4615–22; K. Berer et al., “Commensal Microbiota and Myelin Autoantigen Cooperate to Trigger Autoimmune Demyelination,” Nature 479 (2011): 538–41.

 

[27]E. Y. Hsiao et al., “Microbiota Modulate Behavioral and Physiological Abnormalities Associated with Neurodevelopmental Disorders,” Cell 155, no. 7 (December 19, 2013): 1451–63.

 

[28]P. Gajer et al., “Temporal Dynamics of the Human Vaginal Microbiota,” Science Translational Medicine 4, no. 132 (May 2, 2012): 132ra52; J. Ravel et al., “Daily Temporal Dynamics of Vaginal Microbiota Before, During and After Episodes of Bacterial Vaginosis,” Microbiome 1, no. 1 (December 2, 2013): 29.

 

[29]R. Romero et al., “The Composition and Stability of the Vaginal Microbiota of Normal Pregnant Women Is Different from That of Non-Pregnant Women,” Microbiome 2, no. 1 (Febuary3, 2014): 4.

 

[30]O. Koren et al., “Host Remodeling of the Gut Microbiome and Metabolic Changes During Pregnancy,” Cell 150, no. 3 (August 3, 2012): 470–80.

 

[31]K. Aagaard et al., “The Placenta Harbors a Unique Microbiome,” Science Translational Medicine 6, no. 237 (May 21, 2014): 237ra65.

 

[32]Romero et al., “Composition and Stability of Vaginal Microbiota of Normal Pregnant Women Different from That of Non-Pregnant Women.”

 

[33]Michelle K. Osterman and Joyce A. Martin, “Changes in Cesarean Delivery Rates by Gestational Age: United States, 1996–2011,” NCHS Data Brief , no. 124, June 2013: 1–8; Luz Gibbons et al., The Global Numbers and Costs of Additionally Needed and Unnecessary Cesarean Sections Performed per Year: Overuse as a Barrier to Universal Coverage . Geneva, Switzerland: World Health Organization, 2010.

 

[34]M. G. Dominguez-Bello et al., “Delivery Mode Shapes the Acquisition and Structure of the Initial Microbiota Across Multiple Body Habitats in Newborns,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107, no. 26 (June 29, 2010): 11971–75.

 

[35]G. V. Guibas et al., “Conception via In Vitro Fertilization and Delivery by Caesarean Section Are Associated with Paediatric Asthma Incidence,” Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 43, no. 9 (September 2013): 1058–66; L. Braback, A. Lowe, and A. Hjern, “Elective Cesarean Section and Childhood Asthma,” American Journal of Obstetrics and Gynecology 209, no. 5 (November 2013): 496; C. Roduit et al., “Asthma at 8 Years of Age in Children Born by Caesarean Section,” Thorax 64, no. 2 (February 2009): 107–13; M. C. Tollanes et al., “Cesarean Section and Risk of Severe Childhood Asthma: A Population-Based Cohort Study,” Journal of Pediatrics 153, no. 1 (July 2008): 112–16; B. Xu et al., “Caesarean Section and Risk of Asthma and Allergy in Adulthood,” Journal of Allergy and Clinical Immunology 107, no. 4 (April 2001): 732–33.

 

[36]M. Z. Goldani et al., “Cesarean Section and Increased Body Mass Index in School Children: Two Cohort Studies from Distinct Socioeconomic Background Areas in Brazil,” Nutrition Journal 12, no. 1 (July 25, 2013): 104; A. A. Mamun et al., “Cesarean Delivery and the Long-term Risk of Offspring Obesity,” Obstetrics and Gynecology 122, no. 6 (December 2013): 1176–83; D. N. Mesquita et al., “Cesarean Section Is Associated with Increased Peripheral and Central Adiposity in Young Adulthood: Cohort Study,” PloS One 8, no. 6 (June 27, 2013): e66827; K. Flemming et al., “The Association Between Caesarean Section and Childhood Obesity Revisited: A Cohort Study,” Archives of Disease in Childhood 98, no. 7 (July 2013): 526–32; E. Svensson et al., “Caesarean Section and Body Mass Index Among Danish Men,” Obesity 21, no. 3 (March 2013): 429–33; H. T. Li, Y. B. Zhou, and J. M. Liu, “The Impact of Cesarean Section on Offspring Overweight and Obesity: A Systematic Review and Meta-Analysis,” International Journal of Obesity 37, no. 7 (July 2013): 893–99; H. A. Goldani et al., “Cesarean Delivery Is Associated with an Increased Risk of Obesity in Adulthood in a Brazilian Birth Cohort Study,” American Journal of Clinical Nutrition 93, no. 6 (June 2011): 1344–47; L. Zhou et al., “Risk Factors of Obesity in Preschool Children in an Urban Area in China,” European Journal of Pediatrics 170, no. 11 (November 2011): 1401–6.

 

[37]T. Marrs et al., “Is There an Association Between Microbial Exposure and Food Allergy? A Systematic Review,” Pediatric Allergy and Immunology: Official Publication of the European Society of Pediatric Allergy and Immunology 24, no. 4 (June 2013): 311–20 e8.

 

[38]J. Penders et al., “Establishment of the Intestinal Microbiota and Its Role for Atopic Dermatitis in Early Childhood,” Journal of Allergy and Clinical Immunology 132, no. 3 (September 2013): 601–7 e8; K. Pyrhonen et al., “Caesarean Section and Allergic Manifestations: Insufficient Evidence of Association Found in PopulationBased Study of Children Aged 1 to 4 Years,” Acta Paediatrica 102, no. 10 (October 2013): 982–89; F. A. van Nimwegen et al., “Mode and Place of Delivery, Gastrointestinal Microbiota, and Their Influence on Asthma and Atopy,” Journal of Allergy and Clinical Immunology 128, no. 5 (November 2011): 948–55 e1–3; P. Bager, J. Wohlfahrt, and T. Westergaard, “Caesarean Delivery and Risk of Atopy and Allergic Disease: Meta-Analyses,” Clinical and Experimental Allergy: Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology 38, no. 4 (April 2008): 634–42; K. Negele et al., “Mode of Delivery and Development of Atopic Disease During the First 2 Years of Life,” Pediatric Allergy and Immunology: Official Publication of the European Society of Pediatric Allergy and Immunology 15, no. 1 (February 2004): 48–54.

 

[39]M. B. Azad et al., “Gut Microbiota of Healthy Canadian Infants: Profiles by Mode of Delivery and Infant Diet at 4 Months,” CMAJ: Canadian Medical Association Journal 185, no. 5 (March 19, 2013): 385–94.

 

[40]J. E. Koenig et al., “Succession of Microbial Consortia in the Developing Infant Gut Microbiome,” supplement 1, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108 (March 15, 2011): 4578–85.

 

[41]G. D. Wu et al., “Linking Longterm Dietary Patterns with Gut Microbial Enterotypes,” Science 334, no. 6052 (October 7, 2011): 105–8.

 

[42]G. D. Wu et al., “Linking Longterm Dietary Patterns with Gut Microbial Enterotypes,” Science 334, no. 6052 (October 7, 2011): 105–8.

 

[43]J. Qin et al., “A Human Gut Microbial Gene Catalogue Established by Metagenomic Sequencing,” Nature 464, no. 7285 (March 4, 2010): 59–65.

 

[44]T. Yatsunenko et al., “Human Gut Microbiome Viewed Across Age and Geography,” Nature 486, no. 7402 (May 9, 2012): 222–7.

 

[45]J. H. Hehemann et al., “Transfer of Carbohydrate-Active Enzymes from Marine Bacteria to Japanese Gut Microbiota,” Nature 464, no. 7290 (April 8, 2010): 908–12.

 

[46]P. J. Turnbaugh et al., “A Core Gut Microbiome in Obese and Lean Twins,” Nature 457, no. 7228 (Jan. 22, 2009): 480–4.

 

[47]J. Genuneit et al., “The Combined Effects of Family Size and Farm Exposure on Childhood Hay Fever and Atopy,” Pediatric Allergy and Immunology: Official Publication of the European Society of Pediatric Allergy and Immunology 24, no. 3 (May 2013): 293–98.

 

[48]S. J. Song et al., “Cohabiting Family Members Share Microbiota with One Another and with Their Dogs,” eLife 2 (April 16, 2013): e00458.

 

[49]J. G. Caporaso et al., “Moving Pictures of the Human Microbiome,” Genome Biology 12, no. 5 (2011): R50.

 

[50]M. J. Claesson et al., “Gut Microbiota Composition Correlates with Diet and Health in the Elderly,” Nature 488, no. 7410 (August 9, 2012): 178–84.

 

[51]P. J. Turnbaugh et al., “DietInduced Obesity Is Linked to Marked but Reversible Alterations in the Mouse Distal Gut Microbiome,” Cell Host & Microbe 3, no. 4 (April 17, 2008): 213–23.

 

[52]M. Vijay-Kumar et al., “Metabolic Syndrome and Altered Gut Microbiota in Mice Lacking Toll-like Receptor 5,” Science 328, no. 5975 (April 9, 2010): 228–31.

 

[53]Ridaura et al., “Gut Microbiota from Twins Discordant for Obesity Modulate Metabolism in Mice.”

 

[54]D. Mozaffarian et al., “Changes in Diet and Lifestyle and Long-term Weight Gain in Women and Men,” New England Journal of Medicine 364, no. 25 (June 23, 2011): 2392–404.

 

[55]L. A. David et al., “Diet Rapidly and Reproducibly Alters the Human Gut Microbiome,” Nature 505, no. 7484 (January 23, 2014): 559–63.

 

[56]D. P. Strachan, “Hay Fever, Hygiene, and Household Size,” British Medical Journal 299, no. 6710 (Nov. 18, 1989): 1259–60.

 

[57]D. P. Strachan, “Is Allergic Disease Programmed in Early Life?”, Clinical & Experimental Allergy 24, no. 7 (July 1994): 603–5.

 

[58]J. Riedler et al., “Exposure to Farming in Early Life and Development of Asthma and Allergy: A Cross-Sectional Study,” The Lancet 358, no. 9288 (Oct. 6, 2001): 1129–33.

 

[59]S. Illi et al., “Protection from Childhood Asthma and Allergy in Alpine Farm Environments – the GABRIEL Advanced Studies,” Journal of Allergy and Clinical Immunology 129, no. 6 (June 2012): 1470–7.

 

[60]Braun-Fahrländer et al., “Environmental Exposure to Endotoxin and Its Relation to Asthma in School-Age Children,” New England Journal of Medicine 347, no. 12 (Sept. 19, 2002): 869–77.

 

[61]J. Douwes et al., “Does Early Indoor Microbial Exposure Reduce the Risk of Asthma? The Prevention and Incidence of Asthma and Mite Allergy Birth Cohort Study,” Journal of Allergy and Clinical Immunology 117, no. 5 (May 2006): 1067–73.

 

[62]S. Lau et al., “Early Exposure to House-Dust Mite and Cat Allergens and Development of Childhood Asthma: a Cohort Study. Multicenter Allergy Study Group,” The Lancet 356, no. 9239 (Oct. 21, 2000): 1392–7.

 

[63]M. J. Ege et al., “Exposure to Environmental Microorganisms and Childhood Asthma,” New England Journal of Medicine 364, no. 8 (Feb. 24, 2011): 701–9.

 

[64]E. Y. Hsiao et al., “Microbiota Modulate Behavioral and Physiological Abnormalities Associated With Neurodevelopmental Disorders,” Cell 155, no. 7 (Dec. 19, 2013): 1451–63.

 

[65]N. Elazab et al., “Probiotic Administration in Early Life, Atopy, and Asthma: a Meta-Analysis of Clinical Trials,” Pediatrics 132, no. 3 (Sept. 2013): 666–76.

 

[66]A. A. Niccoli et al., “Preliminary Results on Clinical Effects of Probiotic Lactobacillus Salivarius LS01 in Children Affected by Atopic Dermatitis,” Journal of Clinical Gastroenterology 48, supplement 1 (Nov-Dec 2014): S34–6.

 

[67]M. C. Arrieta and B. Finlay, “The Intestinal Microbiota and Allergic Asthma,” Journal of Infection 4453, no. 14 (Sept. 25, 2014): 227–8.

 

[68]A. Du Toit, “Microbiome: Clostridia Spp. Combat Food Allergy in Mice,” National Review of Microbiology 12, no. 10 (Sept. 16, 2014): 657.

 

[69]A. T. Stefka et al., “Commensal Bacteria Protect Against Food Allergen Sensitization,” Proceedings of the National Academy of Sciences 111, no. 36 (Sept. 9, 2014): 13145–50.

 

[70]M. Noval Rivas et al., “A Microbiota Signature Associated With Experimental Food Allergy Promotes Allergic Sensitization and Anaphylaxis,” Journal of Allergy and Clinical Immunology 131, no. 1 (Jan. 2013): 201–12.

 

[71]M. S. Kramer et al., “Promotion of Breastfeeding Intervention Trial (PROBIT): a ClusterRandomized Trial in the Republic of Belarus. Design, Follow-Up, and Data Validation,” Advances in Experimental Medicine and Biology 478 (2000): 327–45.

 

[72]H. Kronborg et al., “Effect of Early Postnatal Breastfeeding Support: a Cluster-Randomized Community Based Trial,” Acta Pediatrica 96, no. 7 (July 2007): 1064–70.

 

[73]I. Hanski et al., “Environmental Biodiversity, Human Microbiota, and Allergy Are Interrelated,” Proceedings of the National Academy of Sciences 109, no. 21 (May 22, 2012): 8334–9.

 

[74]C. G. Carson, “Risk Factors for Developing Atopic Dermatitis,” Danish Medical Journal 60, no. 7 (July 2013): B4687.

 

[75]E. von Mutius et al., “The PASTURE Project: E. U. Support for the Improvement of Knowledge About Risk Factors and Preventive Factors for Atopy in Europe,” Allergy 61, no. 4 (April 2006): 407–13.

 

[76]S. J. Song et al., “Cohabiting Family Members Share Microbiota With One Another and With Their Dogs,” eLife 2 (April 16, 2013).

 

[77]B. Brunekreef et al., “Exposure to Cats and Dogs, and Symptoms of Asthma, Rhinoconjunctivitis, and Eczema,” Epidemiology 23, no. 5 (Sept. 2012): 742–50.

 

[78]I. Trehan et al., “Antibiotics as Part of the Management of Severe Acute Malnutrition,” New England Journal of Medicine 368, no. 5 (January 31, 2013): 425–35.

 

[79]M. I. Smith et al., “Gut Microbiomes of Malawian Twin Pairs Discordant for Kwashiorkor,” Science 339, no. 6119 (February 1, 2013): 548–54.

 

[80]Turnbaugh et al., “Core Gut Microbiome in Obese and Lean Twins.”

 

[81]D. N. Frank et al., “MolecularPhylogenetic Characterization of Microbial Community Imbalances in Human Inflammatory Bowel Diseases,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, no. 34 (August 21, 2007): 13780–85; M. Tong et al., “A Modular Organization of the Human Intestinal Mucosal Microbiota and Its Association with Inflammatory Bowel Disease,” PloS One 8, no. 11 (November 19, 2013): e80702.

 

[82]J. U. Scher et al., “Expansion of Intestinal Prevotella Copri Correlates with Enhanced Susceptibility to Arthritis,” eLife 2 (November 5, 2013): e01202.

 

[83]P. Bercik, “The MicrobiotaGut-Brain Axis: Learning from Intestinal Bacteria?”, Gut 60, no. 3 (March 2011): 288–89.

 

[84]J. F. Cryan and S. M. O’Mahony, “The Microbiome-Gut-Brain Axis: From Bowel to Behavior,” Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society 23, no. 3 (March 2011): 187–92.

 

[85]A. Naseribafrouei et al., “Correlation Between the Human Fecal Microbiota and Depression,” Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society 26, no. 8 (August 2014): 1155–62.

 

[86]G. A. Rook, C. L. Raison, and C. A. Lowry, “Microbiota, Immunoregulatory Old Friends and Psychiatric Disorders,” Advances in Experimental Medicine and Biology 817 (2014): 319–56.

 

[87]D. W. Kang et al., “Reduced Incidence of Prevotella and Other Fermenters in Intestinal Microflora of Autistic Children,” PLoS One 8, no. 7 (2013): e68322.

 

[88]Hsiao et al., “Microbiota Modulate Behavioral and Physiological Abnormalities Associated with Neurodevelopmental Disorders.”

 

[89]Vijay-Kumar et al., “Metabolic Syndrome and Altered Gut Microbiota in Mice Lacking Tolllike Receptor 5.”

 

[90]P. Bercik et al., “The Intestinal Microbiota Affect Central Levels of Brain-Derived Neurotropic Factor and Behavior in Mice,” Gastroenterology 141, no. 2 (August 2011): 599–609, 609 e1–3.

 

[91]R. Diaz Heijtz et al., “Normal Gut Microbiota Modulates Brain Development and Behavior,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, no. 7 (February 15, 2011): 3047–52.

 

[92]C. L. Ohland et al., “Effects of Lactobacillus Helveticus on Murine Behavior Are Dependent on Diet and Genotype and Correlate with Alterations in the Gut Microbiome,” Psychoneuroendocrinology 38 (2013): 1738–47.

 

[93]A. R. Mackos et al., “Probiotic Lactobacillus Reuteri Attenuates the Stressor-Enhanced Sensitivity of Citrobacter Rodentium Infection,” Infection and Immunity 81, no. 9 (September 2013): 3253–63.

 

[94]P. A. Kantak, D. N. Bobrow, and J. G. Nyby, “Obsessive-Compulsive-like Behaviors in House Mice Are Attenuated by a Probiotic (Lactobacillus Rhamnosus GG),” Behavioural Pharmacology 25, no. 1 (February 2014): 71–79.

 

[95]Hsiao et al., “Microbiota Modulate Behavioral and Physiological Abnormalities Associated with Neurodevelopmental Disorders.”

 

[96]S. Guandalini et al., “VSL#3 Improves Symptoms in Children with Irritable Bowel Syndrome: A Multicenter, Randomized, Placebo-Controlled, DoubleBlind, Crossover Study,” Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 51, no. 1 (July 2010): 24–30.

 

[97]M. Dapoigny et al., “Efficacy and Safety Profile of LCR35 Complete Freeze-Dried Culture in Irritable Bowel Syndrome: A Randomized, Double-Blind Study,” World Journal of Gastroenterology 18, no. 17 (May 7, 2012): 2067–75.

 

[98]E. Smecuol et al., “Exploratory, Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Study on the Effects of Bifidobacterium Infantis Natren Life Start Strain Super Strain in Active Celiac Disease,” Journal of Clinical Gastroenterology 47, no. 2 (February 2013): 139–47.

 

[99]M. Fr mont et al., “HighThroughput 16S rRNA Gene Sequencing Reveals Alterations of Intestinal Microbiota in Myalgic Encephalomyelitis/ Chronic Fatigue Syndrome Patients,” Anaerobe 22 (August 2013): 50–56.

 

[100]M. Messaoudi et al., “Beneficial Psychological Effects of a Probiotic Formulation (Lactobacillus Helveticus R0052 and Bifidobacterium Longum R0175) in Healthy Human Volunteers,” Gut Microbes 2, no. 4 (July/August 2011): 256–61.

 

[101]Medical Council, General Board of Health, Report of the Committee for Scientific Inquiries in Relation to the Cholera-Epidemic of 1854 (London, England, 1855).

 

[102]C. A. Lozupone et al., “Diversity, Stability and Resilience of the Human Gut Microbiota,” Nature 489, no. 7415 (September 13, 2012): 220–30.

 

[103]S. H. Duncan et al., “Contribution of Acetate to Butyrate Formation by Human Faecal Bacteria,” British Journal of Nutrition 91 (2004): 915–23.

 

[104]World Gastroenterology Organisation, World Gastroenterology Organisation Practice Guideline: Probiotics and Prebiotics (May 2008). www.worldgastroenterology.org/assets/downloads/en/pdf/guidelines/19_probiotics_prebiotics.pdf.

 

[105]Чтобы вы могли получить представление о результатах клинических испытаний: в перекрестном, плацебоконтролируемом, двойном слепом исследовании потребление 30 граммов в день пребиотика под названием изомальт (смесь полиолов 1-О-Dглюкопиранозила-D-маннитола и 6-О-D-глюкопиранозила-Dсорбитаола) в течение четырех недель привело к увеличению доли бифидобактерий на 65 процентов и увеличению общего количества их клеток на 47 процентов по сравнению с потреблением сахарозы. Другими словами, этот пребиотик увеличил количество представителей вида бактерий, который считается полезным, хотя прямое его воздействие на функции кишечника не изучалось. В другом исследовании, где двенадцать добровольцев принимали по 10 граммов инулина в день в течение шестнадцати дней, доля бактерий вида Bifidobacterium adolescentis увеличилась с 0,89 до 3,9 процента от общего количества микробов по сравнению с контрольным периодом без каких-либо пищевых добавок. A. Gostner, “Effect of Isomalt Consumption on Faecal Microflora and Colonic Metabolism in Healthy Volunteers,” British Journal of Nutrition 95, no. 1 (January 2006): 40–50; C. Ramirez-Farias et al., “Effect of Inulin on the Human Gut Microbiota: Stimulation of Bifidobacterium Adolescentis and Faecalibacterium Prausnitzii,” British Journal of Nutrition 101, no. 4 (February 2009): 541–50.

 

[106]H. Steed et al., “Clinical Trial: The Microbiological and Immunological Effects of Synbiotic Consumption – A Randomized Double-Blind Placebo-Controlled Study in Active Crohn’s Disease,” Alimentary Pharmacology & Therapeutics 32, no. 7 (October 2010): 872–83.

 

[107]D. Linetzky Waitzberg, “Microbiota Benefits After Inulin and Partially Hydrolized Guar Gum Supplementation: A Randomized Clinical Trial in Constipated Women,” Nutricion Hospitalaria 27, no. 1 (January/February 2012): 123–29.

 

[108]Z. Asemi et al., “Effects of Synbiotic Food Consumption on Metabolic Status of Diabetic Patients: A Double-Blind Randomized Crossover Controlled Clinical Trial,” Clinical Nutrition 33, no. 2 (April 2014): 198–203.

 

[109]J. A. Applegate et al., “Systematic Review of Probiotics for the Treatment of Community-Acquired Acute Diarrhea in Children,” supplement 3, BMC Public Health 13 (2013): S16.

 

[110]A. P. Hungin et al., “Systematic Review: Probiotics in the Management of Lower Gastrointestinal Symptoms in Clinical Practice – An Evidence-Based International Guide,” Alimentary Pharmacology & Therapeutics 38, no. 8 (October 2013): 864–86.

 

[111]N. P. McNulty et al., “The Impact of a Consortium of Fermented Milk Strains on the Gut Microbiome of Gnotobiotic Mice and Monozygotic Twins,” Science Translational Medicine 3, no. 106 (October 26, 2011): 106ra106.

 

[112]H. J. Kim et al., “A Randomized Controlled Trial of a Probiotic Combination VSL# 3 and Placebo in Irritable Bowel Syndrome with Bloating,” Neurogastroenterology and Motility: The Official Journal of the European Gastrointestinal Motility Society 17, no. 5 (October 2005): 687–96.

 

[113]D. J. Merenstein, J. Foster, and F. D’Amico, “A Randomized Clinical Trial Measuring the Influence of Kefir on Antibiotic-Associated Diarrhea: The Measuring the Influence of Kefir (MILK) Study,” Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine 163, no. 8 (August 2009): 750–54; R. S. Beniwal, “A Randomized Trial of Yogurt for Prevention of Antibiotic-Associated Diarrhea,” Digestive Diseases and Sciences 48, no. 10 (October 2003): 2077–82.

 

[114]“Clostridium Difficile Fact Sheet,” Centers for Disease Control and Prevention, accessed September 2014, www.cdc.gov/hai/eip/pdf/Cdiff-factsheet.pdf.

 

[115]I. Youngster, “Fecal Microbiota Transplant for Relapsing Clostridium Difficile Infection Using a Frozen Inoculum from Unrelated Donors: A Randomized, Open-Label, Controlled Pilot Study,” Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America 58, no. 11 (June 1, 2014): 1515–22; Z. Kassam et al., “Fecal Microbiota Transplantation for Clostridium Difficile Infection: Systematic Review and MetaAnalysis,” American Journal of Gastroenterology 108, no. 4 (April 2013): 500–508.

 

[116]“How Well Do Vaccines Work?”, Vaccines. gov, US Department of Health and Human Services, accessed October 11, 2014, www.vaccines.gov/basics/effectiveness.

 

[117]“Vaccines • Disease,” Immunization Healthcare Branch, accessed October 11, 2014, www.vaccines.mil/Vaccines.

 

[118]Y. Li et al., “On the Origin of Smallpox: Correlating Variola Phylogenics with Historical Smallpox Records,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, no. 40 (October 2, 2007): 15787–92.

 

[119]Rob Stein, “Should Last Remaining Known Smallpox Virus Die?”, Washington Post , March 8, 2011.

 

[120]Z. Wang et al., “Gut Flora Metabolism of Phosphatidylcholine Promotes Cardiovascular Disease,” Nature 472, no. 7341 (April 7, 2011): 57–63.

 

[121]A. D. Kostic et al., “Genomic Analysis Identifies Association of Fusobacterium with Colorectal Carcinoma,” Genome Research 22, no. 2 (February 2012): 292–98.

 

[122]Ley, “Microbial Ecology .”

 

[123]C. A. Lowry et al., “Identification of an Immune-Responsive Mesolimbocortical Serotonergic System: Potential Role in Regulation of Emotional Behavior,” Neuroscience 146, no. 2 (May 11, 2007): 756–72.