Реакция нейтрализации, достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.
Второе место среди защитных реакций занимает реакция нейтрализации, которая служит для определения и характеристики иммунного состояния и его роли как механизма по выведению паразита и нейтрализации продуктов его распада и жизнедеятельности. Как правило, реакцию нейтрализации проводят путем смешивания сыворотки животного с патогенным организмом, по отношению к которому данное животное считается иммунным. После инкубации смесь исследуютin vivo или in vitro на наличие активного патогена. В этом случае, как и в реакции защиты, все присутствующие в сыворотке иммуноглобулины могут участвовать в реакции и проявлять тем самым свою активность in toto. По сравнению с большинством других реакций на антитела эта реакция не связана с каким-либо физическим проявлением, поскольку иммуноглобулины, активно разрушающие патогенный организм, могут не давать подобного эффекта.
Реакция нейтрализации ничего не говорит об общем иммунном состоянии животного, так как в ней участвуют только гуморальные антитела, т. е., как и в большинстве других реакций, активность клеточной иммунной системы здесь не имеет значения. Однако реакция нейтрализации имеет преимущество перед реакцией защиты, заключающееся в том, что она не оказывает отрицательного действия на здоровье подопытного животного и может повторяться неоднократно. При проведении почти всех реакций нейтрализации для демонстрации явления нейтрализации необходима какая-нибудь живая система, будь то целостный организм или культура ткани. В некоторых случаях, таких, как реакция торможения гемагглютинации миксовирусов и вируса чумы крупного рогатого скота, реакция нейтрализации хотя и проводится с «живыми» эритроцитами, однако последние могут использоваться после хранения в условиях консервации.
Реакцию нейтрализации можно полностью провести на одном животном, если патогенный организм ввести с одной стороны, а исследуемую сыворотку с другой стороны тела животного. Однако чаще всего этот организм (или токсин) и содержащие антитела растворы оставляют на некоторое время для взаимодействия in vitro и затем в смеси исследуют активность патогенного организма. Самые первые иммунологические реакции, использованные Фон Берингом и Китазато, принадлежали к реакциям именно такого типа. Эти исследователи установили, что антисыворотка, добавленная к столбнячному токсину, нейтрализует токсическое действие последнего, если смесь вводится морской свинке. С тех пор реакция нейтрализации интенсивно используется в работе с антитоксинными антителами, особенно с антителами против токсина клостридий; ее можно применять также при дифференциации видов внутри рода. Так, например, реакцию нейтрализации in vitro используют для быстрой идентификации Clostridium welchii. Выделяемый этим организмом токсин образует мутное кольцо вокруг колонии, растущей на агаре с сывороткой или яичным белком. Этот феномен называется реакцией Наглера. Он может быть подавлен без уничтожения организма, если до введения микроорганизма над агаровой пластинкой распылить специфический антитоксин.
Токсины можно выделить и очистить и определить для них ЛД50 при помощи метода, описанного в главе 11. После этого путем титрования легко установить эффективность антисыворотки. Для этого растворы с серийным разведением сыворотки смешивают со стандартным количеством ЛД60 токсина и определяют токсическое действие каждой смеси путем инокуляции их группе подопытных животных, например мышей. Выживают те животные, которым введены низкие разведения антисыворотки и соответственно количество антител, достаточное для того, чтобы нейтрализовать токсин. За конечную точку титрования можно выбрать точку, соответствующую такому разведению сыворотки, когда она защищает от гибели только 50% мышей.</P><P> Аналогичным образом реакцию нейтрализации можно применить для титрования антител к бактериям, но особенно полезной она оказалась в работе с вирусами. Причина этого заключается в том, что в последнем случае используется качественная методика культуры ткани, которую можно поддерживать в строго стандартных условиях. Поэтому каждый образец культуры ткани может быть идентичным другим до такой степени, которой нельзя добиться с любыми неинбредными стерильными животными. Другое преимущество реакции нейтрализации заключается в том, что для ее проведения требуется значительно меньше вируса, чем для реакции агглютинации, преципитации или связывания комплемента.</P><P> <SPAN style="letter-spacing: 5px;">50%-ную тканевую цитопатогенную дозу вируса ТЦД50 можно определить точно так же, как это делается при измерении ЛД50 или ИД50. Используемый в этом случае метод основан на том факте, что если тканевую культуру инфицировать вирусом, который способен в ней развиваться, то о наличии большинства инфекций можно судить по появлению признаков цитопатогенного действия па клеточном монослое. В чашке Петри легко увидеть «бляшки» разрушенных клеток на участке взаимодействия отдельной вирусной частицы с монослоем клеточной культуры. Если подобный эффект отсутствует, то о наличии инфекции судят по другим признакам, например адсорбции эритроцитов на поверхности культуры клеток.
В ходе предварительной инкубации с каждым из серийных разведений антисыворотки должно взаимодействовать точно измеренное количество вирусной суспензии, чтобы определить то наименьшее разведение сыворотки, которое уменьшает или полностью устраняет цитопатогенный эффект в результате нейтрализации вируса. Этим способом можно точно определить активность противовирусных антител, т. е. данный метод становится, таким образом, важным средством для измерения нейтрализующей активности сыворотки. По этой причине особенно широко реакция нейтрализации применяется в вирусологии при идентификации вирусов. Однако, при всех своих достоинствах, этот метод требует много времени, исключительной лабораторной отработки и тщательного внимания к деталям.