Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Достоинства и недостатки реакции и области возможного применения в вирусологии.

При проведении реакции преципитации в гелевой среде на агаре (а не в жидкости) можно получить больше данных и количественно проанализировать содержание антигенов и антител. Такая реакция называется реакцией преципитации в геле или реакцией иммунодиффузии. Благодаря высокой аналитической чувствительности и исключительной простоте при постановке эта реакция используется, по-видимому, особенно часто при проведении всех иммунологических исследований. Реакцию преципитации в геле проводят в основном двумя способами. По методу одномерной диффузии один реагент, обычно антитела, равномерно смешивается с агаром, а антиген в физиологическом растворе затем диффундирует в гель. Наиболее удобный метод одномерной диффузии был предложен Оудином. По этому методу антисыворотку смешивают с расплавленным 0,6% -ным агаром, заливают в узкую опытную пробирку и оставляют для застывания агара. Затем в пробирку вносят антиген, и после его диффузии в агар в точке эквивалентности образуется преципитат (рис. 23). Агар вместе с сывороткой можно налить в чашку Петри. В такой модификации этот метод используется при проведении качественной реакции Манчини, описанной ниже (стр. 133). Для растворения агара его вначале нагревают до 100° С и затем после охлаждения, примерно до 45° С, когда он начинает образовывать гель, к нему добавляют сыворотку. Эта температура не оказывает отрицательного влияния па добавленную сыворотку, так как не вызывает повреждения антител.

В реакции, поставленной по методу двойной диффузии в прозрачной агаровой пластинке, навстречу друг другу диффундируют два вещества, образуя преципитат на месте встречи. Согласно методу Экли—Фулторпа, реакцию проводят в пробирке. Вначале в пробирку вносят агар с сывороткой, на него наслаивают прозрачный агар и сверху вносят антиген. Однако чаще других применяется более удобный метод Оухтерлони. На физиологическом или буферном растворе готовят 1%-ный прозрачный агар, добавив в него азид натрия для предотвращения роста бактерий и грибков; после этого агар выливают в чашку Петри слоем толщиной до 3 мм. На поверхности застывшего агара вырезают лунки с помощью полого пробойника или сверла для пробок и в одну из соседних лунок заливают антиген, а в другую — антисыворотку. На месте встречи диффундирующего из этих лунок материала образуется линия преципитации (фото 16).

При наличии множественной системы антиген — антитело образуется несколько линий. Указанное явление имеет исключительное значение для анализа антигенов. Особенно эффективен в этом смысле метод Оухтерлони, поскольку здесь устанавливается концентрационный градиент обоих мигрирующих из лунок компонентов реакции, что повышает резкость линий преципитации в точке эквивалентности. Кроме того, из-за различий антигенов по молекулярному размеру они диффундируют сквозь гель с разной скоростью. Комбинация всех этих явлений в сочетании с тем фактом, что концентрация компонентов в каждой системе бывает неодинаковой, обусловливают разграничение линий преципитации, соответствующих каждой отдельной системе антиген — антитело.

Для идентификации линий преципитации, которые образуются при проведении теста по методу Оухтерлони, в одну из соседних лунок вносят известный антиген для получения реакции с той же антисывороткой. Затем находят идентичные линии преципитации, которые возникают между лунками (фото. 15). Полное совпадение этих линий (реакция идентичности) указывает на идентичность неизвестного материала используемому стандарту. Аналогичным образом можно установить присутствие такого материала в смеси других веществ. Поэтому реакция преципитации приобретает особое значение при определении примесей в биологических препаратах. Вследствие высокой специфичности иммунологических реакций установленное с их помощью сходство является лучшим подтверждением действительной идентичности двух использованных антигенных веществ. Если же эти линии пересекаются друг с другом (реакция неидентичности), это, в свою очередь, является достаточным подтверждением различия двух веществ (рис. 24). Иногда на месте пересечения линий можно увидеть шпоры. Наличие шпор указывает, что два антигена сходны по одним антигенным детерминантам, но различаются по другим.

Реакция диффузионной преципитации по методу Оухтерлони широко используется в лаборатории для идентификации анализа биологических материалов. Несмотря на легкость постановки, эта реакция до сих пор не нашла диагностического применения, так как антитела инфицированных животных часто имеют относительно низкий титр и плохую способность к преципитации. Эту реакцию часто используют для определения антигена. Необходимые в данном случае антитела можно заранее приготовить и отобрать по их специфичности и преципитирующей способности. В таком плане реакция диффузионной преципитации оказалась пригодной для идентификации вируса чумы крупного рогатого скота и дифференциации заболеваний со сходной клиникой, например заболевания слизистых и злокачественный катар. В одну из лунок агаровой пластинки Оухтерлони помещают небольшой кусочек ткани лимфатического узла или его экстракт, а в две другие — стандартный антиген чумы крупного рогатого скота и сыворотку, которая будет преципитировать антиген. Если в результате реакции между сывороткой и каждым из антигенов образуется линия преципитации и эта линия дает реакцию идентичности, следовательно, животное, от которого были взяты лимфатические ткани, было заражено чумой крупного рогатого скота (фото 16).

При идентификации заболевания слизистых в качестве источника антигена используют фрагменты тонкого кишечника и соответствующую антисыворотку.

Таким же образом проводится определение антигенов вируса гепатита и чумы собак в патологическом материале от погибших собак и норок. При диагностике чумы собак можно использовать антисыворотку собак или кроликов к вирусу чумы собак, а также антисыворотку теленка, козы или кролика против чумы крупного рогатого скота (антигены которого дают перекрестную реакцию с антигенами вируса чумы собак). Для выявления антигенов к вирусу чумы собак лучше всего использовать ткани легких, лимфатических узлов и миндалин, а при подозрении на гепатит собак — печень. Кроме того, реакцию Оухтерлони можно применять для диагностики заболеваний домашней птицы и таких, как параличи, используя для этого кроличью антисыворотку к вызывающим эти заболевания вирусам. При работе с антисывороткой домашней птицы в агар для улучшения преципитации следует вводить до 9% NaCl.

Реакцию диффузии в геле можно применять для диагностики заболевания у погибшей птицы, чтобы предупредить возможное распространение инфекции на оставшуюся часть стада. Точно так же при подозрении на одно из основных эпизоотических заболеваний крупных животных для получения соответствующего материала для реакции диффузии в геле можно убить зараженное животное. Иначе говоря, антиген для реакции получить довольно трудно, так как другие возможные их источники (моча, слюна, кожа и т. д.) не изучались с точки зрения их потенциальной пригодности для диагностических реакций подобного типа. Другая трудность состоит в том, что пока зараженное животное будет замечено, скорость образования его собственных антител может оказаться вполне достаточной, чтобы приостановить выделение антигена из тех мест, откуда он мог бы быть легко получен.