Выделение вируса на культуре клеток.
Культуры клеток пригодны для выделения большинства вирусов животных. Для этой цели используют как первично-трипсинизированные, так и перевиваемые и диплоидные культуры клеток.
Заражение культур клеток проводят следующим образом. Из пробирок или матрасов выросшим монослоем клеток удаляют ростовую питательную среду, отмывают монослой клеток от ростовой среды ( в ней могут быть антитела к исследуемому вирусу и неспецифические ингибиторы) раствором Хекса и вносят вируссодержащий материал. После контакта ( 1-1,5 ч) , необходимого для адсобции вируса на клетках, вирусосодержащий материал удаляют и вносят поддерживаюую питательную среду, которая не способствует размножению клеток, не обеспечивает их жизнедеятельности. Пробирки и матрасы помещают в термостат для инкубации. Адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают в клетки, репродуцируются в них и выводят в культуральную жидкость, заражают новые клетки, затем следующие и так до тех пор, пока не останется живых клеток.
Обнаружить вирус в клетках можно следующими методами (или признаками):
1)по цитопатическому действию (ЦПД) или цитопатическому эффекту (ЦПЭ). ЦПД- это любые изменения клеток под влиянием размножающегося в них вируса. Для обнаружения ЦПД зараженные культуры клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа. Формы ЦПД могут быть вемьма разнообраными, что зависит от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т.д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2-3 суток после заражения (энтеровирусы), другие- 1-2 нед. (аденовирусы). Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация, округление клеток, симпластообразование .
Фрагментация - разрушение клеток на отдельные фрагменты (вирус везткулярного стоматита др.)
Округление - клетки принимаю шаровидную форму и отделяются от стекла ( адено-, пикорнавирусы и др.)
Симпластобразование - образование гигантских клеток: цитоплазма соседних клеток сливается в следствие растворения клеточных оболочек и образуется одна большая клетка со многими ядрами( вирус ПГ-3, чумы крупноо рогатого скота и др.);
2) с ее помощью в культуре клеток можно обнаружить некоторые вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами: вирусы ПГ-3, гриппа и др. реакцией гемадсорбции. Гемадсорбцией называется прилипание (адсорбция ) эритроцитов крови на поверхности клеток, зараженных вирусом. Этот метод широко используется при диагностике П-3 крупного рогатого скота, при этом используют эритроциты морской свики (цв.вкл.,рис.19);
3) методом образования “бляшек”. Этот метод технически сложнее других и применяется главным образом для титрования и клонирования вирусов;
4) обнаружение вируса в РИФ. В том случае, если размножение вирусов в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить при помощи флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при дианостике классической чумы свиней, парвовирусных инфекций, бешенства и др.;
5) иммунопероксидазной реакцией;
6) путем обнаружения внутриклеточных включений. Для выявления телец-включений культуру клеток выращивают на покровных стеклах, помещенных в пробирки, заражают испытуемым материалом и через определенные сроки инкубации (при 37°С), стекла промывают, фиксируют и окрашивают различными методами (гематоксилин-эозином, акридиновым оранжевым и др.).
Размножающиеся в культурах клеток вирусы частично или полностью ( в зависимости от степени разрушения клеток) выходят в культурную жидкость, которая и используется как готовая суспензия вируса. Если не все клетки культуры разрушились в результате размножения в них вируса, то их разрушают путем 2-3- кратного замораживания и оттаивания или ультразвуком.
Выделение вируса на куриных эмбрионах.
Куриные эмбрионы чувствительны к большинсту вирусов птиц и к некоторым вирусам млекопитающих (болезни Ньюкасла, гриппа, оспы птиц, ПГ-3 др.). Используют куриные эмбрионы от 5-го до 12-го дня инкубации. Вирусы в них могут репродуцироваться в клетках самого зародыша, хорионаллантоисной (ХАО) и амниотической оболочках, в стенках желточного мешка, накакапливается в этих структурах и в жидкостях аллантоисной и амниотической полостей. В разных структурах могут репродуцироваться различные вирусы.
Разработано несколько методов заражения куриных эмбрионов, но в практике чаще используют слудующие методы:
на ХАО- например, вирусы оспы птиц и др.;
в аллантоисную полость- вирусы гриппа, ПГ-3 крупного рогатого скота, вирус болезни Ньюкасла и др.;
в амниотическую полость- вирусы риппа;
в желточный мешок- вирус ринопневмании лошадей.
В редких случаях используют метод заражения куриных эмбрионов в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО.
Обнаружить вирус в куриных эмбрионах можно по следующим признакам:
по гибели зародыша в определенные характерные для соответствующего вируса сроки инкубации;
по патологоанатомическим изменениям в структурах куриного эмбриона, например, белые узелки (оспины) при оспе птиц, инфекционном ларинготрахеите кур и друих инфекциях или желто-зеленый цвет аллантоисной жидкости при гепатите утят и т.п.;
по реакции гемагглютинации ( для обнаружения гемагглютинирующих вирусов, например, вируса болезни Ньюкасла, гриппа,ПГ-З и др.) При наличии вируса в эмбриональной жидкости куриного эмбриога через 3-7 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвести эритроцитов соответствующего вида животного образуются хлопья эритроцитов (агглютинация) . Так, для выявления вируса ПГ-3 крупного рогатого скота используют эритроциты морской свинки, вирусов гриппа- эритроциты кур и т.д.
Выделение вируса на лабораторных животных.
Для этой цели чаще всего используют белых мышей, белых крыс, золотистых хомячков, морских свинок, кроликов и др. Существует большое количество методов введения инфекционного материала лабораторным животным. Наиболее часто используют внутримышечное, подкожное, внутривенное, интраназальное и интрацеребральное введение, Выбор метода заражения зависит от тропизма исследуемого вируса и вида жиаотного.
За зараженными животными устанавливают контроль, отмечая изменения их поведения, появление специфических признаков болезни( так, вирус болезни Ауески у кроликов вызывает зуд, расчесы в месте инъекции вирусного материала, затем паралич и гибель животного).
Материал для вирусологических исследований от лабораторных животных следует брать как можно быстрее после появления четких специфических признаков болезни или после их гибели ( так, при выявлении вируса ящура на новорожденных мышатах их убивают в агональной стадии и используют скелетные мышцы для приготовления антигена в РСК).
Признаками размножения вируса в организме лабораторных животных после эксперементального заражения служат гибель, клинические симптомы болезни и патологические изменения ( устанавливают при вскрытии). Если зараженное живвотное пало, его немедленно вскрывают, а если не погибло, убивают ( через соответствующий срок) и тоже вскрывают для обнаружения патологоанатомических изменений, взятия вируссодержащего материала и дальнейшего исследвания или следующего пассажа. Использованных животных обезвреживают автоклавированием или сжиганием в специальной печи.
ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСОВ НА ЕСТЕСТВЕННО ВОСПРИИМЧИВЫХ ЖИВОТНЫХ.
Используют редко и только в случаях, когда нет возможности использовать лабораторные чувствительные живые системы (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторных животных).