Изучить схему постановки и учесть РСК в серодиагностике сыпного тифа.

Реакция связывания комплемента (РСК) - это сложная многокомпонентная серологическая реакция, в которой используются две системы AГ- AT (исследуемая и индикаторная) и комплемент в рабочей дозе.

Первую систему называют исследуемой или тест-системой, она содержит один неизвестный компонент (исследуемая сыворотка, в которой определяется наличие антител) и известный компонент (диагностикум). Вторую систему называют индикаторной или гемолитической (эритроциты барана + антитела сыворотки кролика). РСК проходит в два этапа:

1) тест-система (№1) + комплемент - 1 час инкубации при 37ºС

2) добавляют гемолитическую систему (№2) - 1 час инкубации при 37ºС

РСК имеет много компонентов, поэтому ставят несколько контролей. Все компоненты используют в эквивалентных количествах. Постановке основного опыта РСК предшествует титрование комплемента для определения его рабочей дозы, так как при этой реакции необходимо точное соблюдение количественных соотношений ингредиентов.

Титрование комплемента

Из коммерческого препарата комплемента, представляющего собой лиофилизированную сыворотку крови морской свинки, готовят разведения 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35 и 1:40. К 0,2 мл каждого разведения комплемента добавляют по 0,4 мл гемолитической системы (смесь равных объемов 3% суспензии эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика в тройном титре после их инкубации в течение 30 минут). После инкубации пробирок 30 минут при 37ºС определяют титр комплемента – наибольшее его разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в гемолитической системе. В реакции РСК используют рабочую дозу комплемента, которая на 25% больше, чем титр комплемента.

Постановка основного опыта РСК

Если в пробирке на первой стадии присутствуют специфические антитела (в исследуемой сыворотке) и антигены, то они образуют комплекс, который связывает комплемент. При добавлении на второй стадии гемолитической системы гемолиз эритроцитов не может произойти из-за отсутствия свободного комплемента, и они образуют осадок на дне пробирки. Напротив, если из-за отсутствия специфических антител в исследуемой сыворотке иммунный комплекс не образуется, то на первой стадии реакции связывания комплемента не происходит и он взаимодействует с иммунными комплексами в гемолитической системе, вызывая гемолиз эритроцитов. Таким образом, гемолитическая система является индикаторной, то есть показывающей произошло ли связывание комплемента на первой стадии, а это происходит при наличии специфических антител в исследуемой сыворотке. В связи с этим отрицательным результатом РСК считают наличие гемолиза, положительным - отсутствие гемолиза. При этом результат оценивается как резко положительный (++++) при полном отсутствии гемолиза, положительным (+++) при 25% гемолизе, слабо положительным (++) при 50% гемолизе и сомнительным (+) при 75% гемолизе.

Реакция считается специфичной при соответствии результатов во всех контрольных пробирках ожидаемым согласно внесенным в них ингредиентам. При положительном результате в рабочей пробирке, содержащей исследуемую сыворотку в разведении 1:80 (соответствующим диагностическому титру при сыпном тифе) выдается заключение о наличии у больного данного заболевания.

Занятие № 3

ТЕМА: Иммунологические реакции с мечеными ингредиентами: реакция иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноблоттинг (ИБ).

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать технику постановки, механизм и учёт иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализа, реакции иммунофлюоресценции, иммуноблотинга, область применения и информативность указанных выше реакций.

уметь учитывать результаты иммуноферментного анализа, иммуноблотинга.

Вопросы для самоподготовки:

1. Особенности современных серологических реакций с использованием меток

2. Механизм, цели применения реакции иммунофлюоресценции (РИФ), виды РИФ, ингредиенты

3. Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ИФА), ингредиенты

4. Механизм, ингредиенты радиоиммунного анализа (РИА)

5. Механизм, ингредиенты иммуноблоттинга

6. Механизм, ингредиенты иммунной электронной микроскопии (ИЭМ)

2. Контрольные вопросы:

1) Выписать разновидности РИФ ________________________________________________

2) Выписать типы люминесцентных сывороток: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3) Выписать ингредиенты ИФА

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4) Выписать механизм радиоиммунного анализа (РИА)______________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5) Выписать механизм иммуноблоттинга (ИБ )_____________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1. Изучить механизмы прямой и непрямой РИФ для выявления антител к антигенам Chlamidia trachomatis.

№ этапа	Прямая РИФ	Непрямая РИФ

II. УИРС

Интерпретировать результаты серологического исследования в диагностике урогенитального хламидиоза при определении комбинации специфических IgG, IgM, IgA на основе динамики антителообразования при первичном и вторичном иммунном ответе.

Наличие класса антител	Интерпретация
IgG	IgM	IgA
- (+)	+	- (+)
+	-	-
- (+)	-	+

Базовый текст

1. Особенности современных серологических реакций с использованием меток

1. Для проведения этих реакций используют метку (флюоресцеин, фермент или изотоп); которую соединяют (конъюгируют) с АГ или AT;

2. Эти серологические реакции происходят быстрее (экспресс) и качественнее

3. Они являются высокочувствительными и возможна точная регистрация результатов специальными приборами

4. Их проводят на стекле или в полистироловых планшетах с лунками;

Требования к меткам:

а) не изменять специфичность AT или АГ

б) быстро и легко выявляться

в) определяются количественно

Основные виды меток:

а) светящиеся красители - флюорохромы. Такие серологические - реакции называют реакциями иммунной флюоресценции (РИФ)

б) ферменты - реакции иммуноферментного анализа (ИФА)

в) радиоактивные изотопы- реакции радиоиммунного анализа (РИА)

г) электронно-плотные белки - реакции иммунноэлектронной микроскопии (ИЭМ)

Меченые сыворотки выпускаются 2 разновидностей:

– антимикробные меченые сыворотки, содержащие антитела против определенных видов бактерий, вирусов, риккетсий, хламидий;

– антиглобулиновые меченые сыворотки, содержащие антитела против гамма-глобулинов крови человека или животных.