Цикл v «прикладная иммунология»

ЦИКЛ V «Прикладная иммунология»

Занятие № 1

ТЕМА ЗАНЯТИЯ: Серологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Реакции агглютинации (РА), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА).

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать определение понятия «антиген»; свойства антигенов; виды антигенов; структуру молекулы иммуноглобулина; свойства классов иммуноглобулинов; серологический метод диагностики инфекционных заболеваний; реакция агглютинации (РА): механизм и виды.

уметь ставить и учитывать реакцию агглютинации на стекле, развёрнутую реакцию агглютинации; учитывать реакцию пассивной гемагглютинации (РПГА).

1. Вопросы для самоподготовки:

1. Понятие «иммунитет». Виды иммунитета

2. Клеточные факторы врожденного иммунитета. Фагоцитоз

3. Иммунная система организма. Основные клетки иммунной системы и их характеристика

4. Гуморальные факторы врожденного иммунитета

5. Система комплемента, пути ее активации

6.Определение понятия «антиген». Свойства антигенов. Виды антигенов

7.Определение понятия «антитело». Классы антител и их свойства

8.Иммунный ответ и этапы межклеточной кооперации при гуморальном иммунитете

9.Этапы межклеточной кооперации при клеточном иммунном ответе

10. Иммунологические реакции: определение, применение для диагностики инфекционных заболеваний

11. Серологический метод

12. Реакция агглютинации и ее виды

13. Механизм реакции пассивной гемагглютинации. Эритроцитарные диагностикумы

2. Контрольные вопросы:

1) Выписать виды антигенов

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2) Выписать свойства антигенов

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3) Выписать свойства классов антител

Название класса	Свойства

4) Перечислить этапы межклеточной кооперации при клеточном и гуморальном иммунитете

5) Выписать механизм и виды реакций агглютинации______________________
_____________________________________________________________________________

6) Выписать механизм реакции пассивной гемагглютинации _______________
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Базовый текст

Другие защитные белки сыворотки крови

К белкам острой фазы относятся С-реактивный белок, фибриноген, церрулоплазмин и другие, которые вырабатываются в печени в ответ на повреждение тканей и клеток. Способствуют опсонизации бактерий, защищают ткани от повреждения, является индикаторами воспаления – так как их концентрация при этом многократно увеличивается.

Маннозосвязывающий белок -нормальный протеин сыворотки крови. Способен прочно связываться с остатками маннозы, находя­щимися на поверхности микробных клеток, и опсонизировать их. Способствует фагоцитозу, активирует систему комплемента по лектиновому пути.

Пропердин -представляет собой гамма-глобулин нормальной сыворотки крови. Способствует активации комплемента по аль­тернативному пути и таким образом участвует во многих иммунологических реакциях.

Фибронектин -универсальный белок плаз­мы и тканевых жидкостей, синтезируемый макрофагами. Обеспечивает опсонизацию ан­тигенов и связывание клеток с чужеродными веществами, например фагоцитов с антигенами и микробами, экранирует дефекты эндотелия сосудов, препятствуя тромбообразованию.

Бета-лизины -белки сыворотки крови, синтезируемые тромбоцитами. Оказывают повреждающее действие на цитоплазматическую мембрану бактерий.

Таблица 27. Характеристика отдельных классов иммуноглобулинов

Признак	IgG	IgA	IgM	IgD	IgE
Мол. масса	160.000	170.000	970.000	184.000	188.000
Структура	мономер	в плазме -мономер, в секретах -димер	пентамер	мономер	мономер
Легкие цепи	k + l	k + l	k + l	k + l	k + l
Тяжелые цепи	g	a	m	d	e
Число антиген-связывающих мест (Fab-фрагментов) - валентность		2 (4)
Период полувыведения из сыворотки	18-23 дня	6 дней	5 дней	3 дня	2 дня
Фиксация комплемента	+	-	+	-	-
Прохождение через плаценту	+	-	-	-	-
Функция основная	Защита от микроор-ганизмов и токсинов	Защита слизистых поверхностей от микроор-ганизмов	Первичный иммунный ответ на инфекцию	Не известна	Цитотропность к базофилам и тучным клеткам, стимуляция выброса гистамина при аллергии
Присутствие в биологических жидкостях	Плазма крови и межкле-точная жидкость	Сыворотка, слюна, секреты ЖКТ и бронхов, молоко, сперма	В основном в сыворотке, немного в межклеточной жидкости	Поверхность В-лимфоцитов	На поверхности тучных клеток и базофилов; немного в сыворотке и тканевой жидкости

Серологический метод

От латинского serum – сыворотка: серология - раздел иммунологии, изучающий закономерности взаимодействия АГ и AT сыворотки крови. Соответственно реакции АГ+АТ, происходящие in vitro, называются серологическими реакциями. Серология имеет огромное прикладное и практическое значение в современной клинической лабораторной диагностике инфекционных, аутоиммунных, эндокринных и других заболеваний.

Серологический метод исследования (диагностики) - это метод, основанный на изучении сыворотки больного с целью определения в ней антител. В настоящее время понятие серологического метода расширено, так как разработаны высокочувствительные серологические реакции, предполагающие обнаружение AT не только в сыворотке крови больных, но и в других биологических жидкостях: слюне, ликворе, биосекретах).

Основные характеристики:

1) взаимодействие АГ и AT строго специфично;

2) серологическая реакция проходит при эквивалентных (соответствующих друг другу) соотношениях количества АГ и AT;

3) серологическая реакция имеет двухфазный характер:

- специфическое взаимодействие – фаза невидимая

- образование видимых комплексов – для этого добавляют физиологический раствор

4) серологическая реакция проходит по типу физико-химической реакции в коллоидной системе;

5) выделяется небольшое количество тепла.

Цели применения серологических реакций:

1) серологическая идентификация - это определение вида неизвестного АГ при помощи известных AT (иммунной диагностической сыворотки). В этом случае:

а) неизвестные АГ - это микроорганизмы патогенные и непатогенные, токсины разного происхождения, белки крови, клетки разных органов и ткани другого вида или группы, клетки трансплантанта;

б) известные AT - это стандартные препараты - иммунные диагностические сыворотки (ИДС) специфичные определённому (искомому) АГ

2) серологическая диагностика (метод) - это определение неизвестных AT в сыворотке крови или других биологических жидкостях больного с помощью известного АГ (диагностикума).

а) неизвестные AT - это искомые AT сыворотки крови людей - больных, переболевших, носителей, вакцинированных;

б) диагностикумы - это стандартные препараты, которые получают из чистых культур микроорганизмов определенных видов или их АГ. Микроорганизмы выращивают, затем инактивируют, стандартизируют (количество микробов в единице объема); инактивацию проводят: нагреванием, формалином, спиртом и т.д. (диагностикум теряет патогенность, но сохраняет антигенные свойства).

Основные понятия серологии Диагностикум - взвесь убитых микробов. Титр антител - наибольшее разведение исследуемой сыворотки, при котором произошла положительная реакция (агглютинации, связывания комплемента и т.п.). Диагностический титр – наименьший титр специфических антител у больного данной инфекцией человека, с которого реакция может считаться специфической (положительной). Парные сыворотки – двесыворотки одного пациента, первая из которых берется при первом обращении пациента (на 5-8 день заболевания), вторая – через 10-14 дней, с целью оценить динамику иммунного ответа. Феномен нарастания титра антител - увеличение концентрации специфических антител в исследуемых парных сыворотках в 4 и более раз, свидетельствующее о наличие данного заболевания у человека в данный момент.

Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации (РА)(лат. agglutinatio - склеивание) реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных (нерастворимых) антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, имеющими два или более антигенсвязывающих центра). РА используют для: определения антител в сыворотке крови больных (например, при бруцеллезе - реакции Райта, Хеддельсона, при брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекциях), идентификации возбудителя, выделенного от больного;

Для определения у больного антител ставятразвернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум и через 2 часа инкубации при 37 °С и 18-20 часов при комнатной температуре отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и Н-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении с физиологическим раствором 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю изотонического раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка истепени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без комков.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Занятие № 2

Схема постановки РСК

1 система 2 система

Компоненты

Характери-

стика

компонентов

I фаза II фаза

Инкубация при ____◦С в течение _______ Инкубация при ____◦С в течение____

Базовый текст

III. План практической работы

1. Изучить технику постановки и учесть реакцию преципитации (РП) в геле с целью определения токсигенности дифтерийной палочки (РН токсина антитоксической сывороткой).

Полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической противодифтерийной сывороткой, накладывают на поверхность прозрачного агара в чашке Петри. Культуры дифтерийной палочки сеют бляшками на расстоянии 0,6-0,8 см от полоски фильтровальной бумаги и 1-1,5 см друг от друга. Исследуемые и контрольную (токсигенную) культуры дифтерийной палочки чередуют с одной стороны полоски фильтровальной бумаги, а напротив, с другой стороны полоски сеют одноименные культуры (дубли). Чашку инкубируют при 37^◦С в течение 24-48 часов. Затем проводят учет. Положительной реакция считается при наличии тонкой линии преципитата между полоской фильтровальной бумаги и ростом бактерий в виде бляшки, отрицательной – при её отсутствии. Реакция считается специфичной, если контрольная культура дала положительный результат.

2. Поставить и учесть реакцию кольцепреципитации Асколи в диагностике сибирской язвы (с целью обнаружения антигенов возбудителя сибирской язвы в исследуемом материале).

Из органов трупа животного (селезенки, участков воспаления и геморрагий кишечной стенки, легких) готовят термоэкстракт, путем кипячения в изотоническом растворе хлорида натрия и фильтрования, возможно содержащий термостабильный антиген возбудителя сибирской язвы. Реакцию ставят в узких преципитационных пробирках, внося равные объемы (0,3-0,5 мл) каждого компонента, причем второй компонент реакции осторожно наслаивают на первый, наклоняя пробирку под углом 45^◦. Реакция ставится согласно схеме (таблица).

Ингредиенты	Рабочая пробирка	Отрицательный контроль сыворотки	Положительный контроль сыворотки	Контроль термоэкстракта
Исследуемый материал (термоэкстракт из органов животного)	+			+
Диагностикум (стандартный сибиреязвенный антиген)			+
Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка (на дно)	+	+	+
Нормальная сыворотка животного (на дно)				+
Изотонический раствор NaCl		+

В случае наличия антигенов возбудителя сибирской язвы втермоэкстрактена границе между жидкостями появляется мутно-белое кольцо преципитата не позднее, чем через 15 минут.

Титрование комплемента

Из коммерческого препарата комплемента, представляющего собой лиофилизированную сыворотку крови морской свинки, готовят разведения 1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35 и 1:40. К 0,2 мл каждого разведения комплемента добавляют по 0,4 мл гемолитической системы (смесь равных объемов 3% суспензии эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика в тройном титре после их инкубации в течение 30 минут). После инкубации пробирок 30 минут при 37ºС определяют титр комплемента – наибольшее его разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в гемолитической системе. В реакции РСК используют рабочую дозу комплемента, которая на 25% больше, чем титр комплемента.

Занятие № 3

ТЕМА: Иммунологические реакции с мечеными ингредиентами: реакция иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноблоттинг (ИБ).

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать технику постановки, механизм и учёт иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализа, реакции иммунофлюоресценции, иммуноблотинга, область применения и информативность указанных выше реакций.

уметь учитывать результаты иммуноферментного анализа, иммуноблотинга.

Вопросы для самоподготовки:

1. Особенности современных серологических реакций с использованием меток

2. Механизм, цели применения реакции иммунофлюоресценции (РИФ), виды РИФ, ингредиенты

3. Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ИФА), ингредиенты

4. Механизм, ингредиенты радиоиммунного анализа (РИА)

5. Механизм, ингредиенты иммуноблоттинга

6. Механизм, ингредиенты иммунной электронной микроскопии (ИЭМ)

2. Контрольные вопросы:

1) Выписать разновидности РИФ ________________________________________________

2) Выписать типы люминесцентных сывороток: __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3) Выписать ингредиенты ИФА

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4) Выписать механизм радиоиммунного анализа (РИА)______________________________

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5) Выписать механизм иммуноблоттинга (ИБ )_____________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1. Изучить механизмы прямой и непрямой РИФ для выявления антител к антигенам Chlamidia trachomatis.

№ этапа	Прямая РИФ	Непрямая РИФ

II. УИРС

Интерпретировать результаты серологического исследования в диагностике урогенитального хламидиоза при определении комбинации специфических IgG, IgM, IgA на основе динамики антителообразования при первичном и вторичном иммунном ответе.

Наличие класса антител	Интерпретация
IgG	IgM	IgA
- (+)	+	- (+)
+	-	-
- (+)	-	+

Базовый текст

1. Особенности современных серологических реакций с использованием меток

1. Для проведения этих реакций используют метку (флюоресцеин, фермент или изотоп); которую соединяют (конъюгируют) с АГ или AT;

2. Эти серологические реакции происходят быстрее (экспресс) и качественнее

3. Они являются высокочувствительными и возможна точная регистрация результатов специальными приборами

4. Их проводят на стекле или в полистироловых планшетах с лунками;

Требования к меткам:

а) не изменять специфичность AT или АГ

б) быстро и легко выявляться

в) определяются количественно

Основные виды меток:

а) светящиеся красители - флюорохромы. Такие серологические - реакции называют реакциями иммунной флюоресценции (РИФ)

б) ферменты - реакции иммуноферментного анализа (ИФА)

в) радиоактивные изотопы- реакции радиоиммунного анализа (РИА)

г) электронно-плотные белки - реакции иммунноэлектронной микроскопии (ИЭМ)

Меченые сыворотки выпускаются 2 разновидностей:

– антимикробные меченые сыворотки, содержащие антитела против определенных видов бактерий, вирусов, риккетсий, хламидий;

– антиглобулиновые меченые сыворотки, содержащие антитела против гамма-глобулинов крови человека или животных.

Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ИФА), ингредиенты

Иммуноферментный анализ (ИФА)используется для выявлениямикробных антигенов или противомикробных антител с помощью антител, конъюгированных с ферментной меткой (пероксидазой хре­на или щелочной фосфатазой). После соединения иммунного комплекса с ме­ченной ферментом иммунной сывороткой добавляют субстратно-хромогенрую смесь. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции. При этом интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связав­шихся молекул антигена и антител.ИФАприменяют для диагностики вирус­ных, бактериальных и паразитарных болезней в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормо­нов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в низких концентрациях - 10^-10 - 10^-12 г/л.

Твердофазный ИФАявляется наиболее распростра­ненным вариантом ИФА, когда один из компонентов иммунной реак­ции (антигены или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микроплан­шетов из полистирола (рис. 25). При определении антител в лунки микроплан­шетов с сорбированными антигенами последова­тельно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную фер­ментом, субстрат для фермента (Н₂О₂ или фосфатид) и хромоген (индикатор, окрашивающий продукт ферментации). Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный но­ситель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят иско­мый антиген, добавляют иммунную сыворот­ку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрат для фермента и хромоген.

Рис. 25. Принцип постановки ИФА для обнаружения антимикробных антител

Механизм, ингредиенты радиоиммунного анализа (РИА)

Радиоиммунологический анализ (РИА) -высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с примене­нием антигенов или антител, меченных ра­диоизотопами (^l25J, ¹⁴С, ³Н, ⁵¹Сr и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и опре­деляют его радиоактивность в соответствую­щем счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорцио­нальна количеству связавшихся молекул ан­тигена и антител. При твердофазном варианте РИАодин из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. При другом варианте метода - конкурентном РИА -ис­комый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за свя­зывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант исполь­зуют для определения количества антигена в исследуемом материале. РИАприменяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, фермен­тов, лекарственных веществ и иммуноглобу­линов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в низких концент­рациях - 10^-10 - 10^-12 г/л.

Таблица 28. Интерпретация результатов, основанных на определении комбинации IgG, IgM, IgA

Наличие класса антител	Интерпретация
IgG	IgM	IgA
- (+)	+	- (+)	Острая стадия заболевания
+	-	-	Перенесенная или текущая инфекция
- (+)	-	+	Текущая или хроническая инфекция

Рис. 26. Типичная динамика гуморального ответа на первичное и повторное инфицирование

Занятие № 4

ТЕМА: Оценка иммунного статуса человека. Иммунопрофилактика и иммунотерапия: вакцины, сыворотки, иммуноглобулины, бактериофаги. Иммунодиагностика: диагностикумы, аллергены, бактериофаги. Медицинская биотехнология.

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЯ: знать тесты оценки иммунного статуса человека: клеточных и гуморальных факторов врожденного и приобретенного иммунитета; методы их определения; механизм, технику постановки и учёт реакции Манчини; механизм, технику постановки и учёт теста определения титра комплемента, методы получения биологических препаратов: вакцин, сывороток, иммуноглобулинов, аллергенов, диагностикумов, бактериофагов; сроки плановой вакцинации и ревакцинации; биотехнологические методы.

уметьучитывать реакцию Манчини; учитывать тест

1. Вопросы для самоподготовки

1. Иммунный статус человека. Понятие, уровни, тесты оценки

2. Тесты оценки иммунного статуса человека I уровня и методы их определения

3. Тесты оценки иммунного статуса человека II уровня и методы их определения

4. Реакция Манчини: цель, механизм и ингредиенты реакции Манчини

5. Механизм, ингредиенты, постановка реакции определения титра комплемента

6. Понятие об иммунопрофилактике и иммунотерапии. Показания к вакцинации и противопоказания

7. Виды и методы получения вакцин

8. Метод получения, цель применения анатоксинов

9. Природа, цели применения адьювантов

10. Виды, методы получения, цели применения иммунных сывороток

11. Цели применения бактериофагов

12. Иммунологические препараты для диагностики инфекционных заболеваний

13. Виды, методы получения и цели применения диагностикумов

14. Аллергены, методы получения и цель использования

2. Контрольные вопросы:

1) Выписать определение «иммунный статус человека» тесты оценки иммунного статуса человека ____________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

2) Выписать уровни оценки иммунного статуса человека, назвать их различия _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

3) Реакция Манчини: а) выписать цель ___________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

б) выписать название механизма реакции _________________________________________ _____________________________________________________________________________

в) выписать ингредиенты ______________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4) Выписать ингредиенты реакции титрования комплемента _______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5) Выписать название показателей иммунограммы и их значение у здоровых лиц

Название	Значение	Единицы измерения

6) Выписать методы получения вакцин: ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7) Выписать виды вакцин:

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

8) Выписать методы получения а) сывороток: ____________________________________

_____________________________________________________________________________

9) иммуноглобулинов___________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

10) Выписать виды сывороток: __________________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

11) Выписать цели использования аллергенов ______________________________________
_____________________________________________________________________________
12) Выписать цель использования диагностикумов __________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

13) Выписать цель использования бактериофагов

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

1. Записать тесты для оценки иммунного статуса человека и методы их определения.

Базовый текст

Таблица 29. Тесты оценки иммунного статуса I уровня

Тест	Метод определения
Лейкоцитарная формула (относительное и абсолютное количество нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов и лимфоцитов)	Световая микроскопия мазка крови, окрашенного по Романовскому-Гимзе
Относительное и абсолютное количество Т-лимфоцитов (CD3+ клеток)	Проточная цитофлюориметрия
относительное и абсолютное количество Т-лимфоцитов (Т-хелперов (CD4+ клеток), Т-киллеров (CD8+ клеток), индекса соотношения CD4/CD8)	Проточная цитофлюориметрия
Относительное и абсолютное количество В-лимфоцитов (CD20+ клеток)	Проточная цитофлюориметрия
Концентрация иммуног­лобулинов А, М, G	Реакция Манчини; ИФА
Показатели фагоцитоза (фагоцитарный индекс, фагоцитарное число, коэффициент завершенности фагоцитоза)	Световая микроскопия мазков крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе; расчет показателей активности фагоцитоза.
Титр комплемента	Реакция иммунного гемолиза
Количество иммунных комплексов	Турбидиметрия (метод анализа мутных сред, основанный на измерении интенсивности поглощённого ими света).

3. Тесты оценки иммунного статуса человека II уровня и методы их определения

При наличии отклонений вориентиру­ющих тестах более тщательный анализ иммунологического статуса рекомендуется проводить с помощью аналитических тестов вто­рого уровня.Для установления выраженности и уровня иммуно­логического дефекта, определения механизмов функциональных нарушений звеньев иммунитета изучают следующие показатели (табл. 30).

Таблица 30. Тесты оценки иммунного статуса II уровня

Тест	Метод определения
Относительное и абсолютное количество Т-хелперов 1 и 2 типов	Проточная цитофлюориметрия
Относительное и абсолютное количество натуральных киллеров (NK-клеток, CD16+, 56+ клеток)	Проточная цитофлюориметрия
Относительное и абсолютное количество активированных Т-лимфоцитов (несущих HLA-DR)	Проточная цитофлюориметрия
Относительное и абсолютное количество популяций В-лимфоцитов (наивных, памя­ти, иммунных, синтезирующих разные классы иммуноглобули­нов)	Проточная цитофлюориметрия
Активность спонтанной и активированной бластной трансформации лимфоцитов	Реакция бластной трансформации лимфоцитов (РБТЛ)
Определение уровеней цитокинов (интерлейкинов (ИЛ)-1, 2, 4, 5, 6, 8, 10; интерферонов (ИФН) α- и γ) в крови	ИФА
Определение бактерицидности нейтрофилов в тестах хемилюминисценции и восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест)	Реакция хемилюминесценции; Световая микроскопия мазков крови, окрашенных нейтральным красным
Количество компонентов комплемента (С3, С1, С3а, С5а и др.)	ИФА
Определение специфических онкомаркеров	ИФА
Определение уровней специфических аутоантител.	ИФА

Таблица 31. Показатели иммунограммы и их значение у здоровых лиц

Название	Значение	Единицы измерения
Лимфоциты (всего)		%
В-лимфоциты	15 (10 - 25)	%
Т-лимфоциты (всего)	75 (60 - 90)	%
Т-лимфоциты/хелперы	50 (32 - 65)	%
Т-лимфоциты/киллеры	25 (16 - 39)	%
NK-клетки	10 (5 - 15)	%
Ig G	12 (7,5 – 15,5)	г/л
Ig M	1,2 (0,65 – 1,65)	г/л
Ig A	2 (1,25 – 2,5)	г/л
Ig E	0,0005 (0 – 0,0005)	г/л

Основные правила интерпретации иммунограмм:

1. Комплексный анализ иммунограммы более информативен, чем оценка каждого показателя в отдельности.

2. Анализ иммунограммы в динамике всегда более информативен как в диагностическом, так и в прогностическом отношении, нежели однократно полученная иммунограмма.

3. Реальную информацию несут лишь сильные сдвиги показателей (не менее 20% от нормы);

4. Полноценный анализ иммунограммы можно проводить лишь в комплексе с оценкой клинической картины заболевания у данного пациента.

5. Учет возможных индивидуальных особенностей (возраст, сопутствующие заболевания) и колебаний показателей (физиологических и патологических - прием пищи, физические нагрузки, время суток, действие стрессоров и т.д.), учет региональных норм.

6. Отсутствие существенных сдвигов показателей иммунограммы при наличии выраженной картины воспалительного процесса свидетельствует об атипичной реакции иммунной системы и является отягощающим признаком течения процесса.

7. В подавляющем большинстве случаев анализ иммунограммы позволяет делать ориентировочные, а не безусловные выводы.

Дивергентные вакцины

Такие вакцины готовят из неболезнетворных для человека микробов или вирусов, имеющих общие антигены с возбудителями опасных инфекционных заболеваний.

Примером этих вакцин была вакцина для профилактики натуральной оспы. Ее готовили из вируса коровьей оспы. Для этого собирали материал из везикулярных поражений кожи, зараженных коровьей оспой телят и консервировали его в глицерине. Затем был разработан метод приготовления осповакцины на куриных эмбрионах и культуральной вакцины, приготовленной из вируса, выращенного в культуре клеток. В настоящее время по рекомендации ВОЗ обязательная вакцинация против оспы отменена, так как последний случай заболевания оспой был зарегистрирован в Сомали в 1977 году.

Комбинированные вакцины

Комбинированные (ассоциированные) вакцины - препараты, включающие несколько разнородных антигенов и позво­ляющих проводить иммунизацию против не­скольких инфекций одновременно, применяются с целью сокращения числа вакцин и числа инъекций при проведении массовой вакцинопрофилактики. Они могут состоять как из однородных антигенов, так и из антигенов разной природы. Основная задача при создании ассоциированных вак­ци