Раздел V. Биохимия витаминов и гормонов.
Тема 5.2. Обмен и функции витаминов В5, В6, В7, В9, В12, С.
Качественные реакции на ниацин (витамин РР, никотиновая кислота, никотинамид)
Принцип метода. Биологическая функция ниацина заключается в том, что никотинамид служит активной частью коферментов НАД+ или НАДФ+, участвующих в окислительно-восстановительных реакциях. РР-авитаминоз выражается в виде дерматита на симметричных участках тела, расстройствах деятельности желудочно-кишечного тракта, нервной системы.
Ход определения. 1. Качественная реакция ниацина с медью. Щепотку порошка (5-10 мг) витамина РР растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10%-ного раствора уксусной кислоты. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем 5%0ного раствора ацетата меди. Жидкость становится мутной, при стоянии выпадает осадок синего цвета.
2. Качественная реакция обнаружения аминогруппы. Небольшое количество порошка витамина РР помещают в пробирку, прибавляют 2 мл 0,1 моль/л раствора гидроксида натрия и нагревают. Ощущают запах аммиака, который образуется при расщеплении амидной связи в молекуле ниацина.
К методическим рекомендациям
ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ
НА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЯХ
Раздел V. Биохимия витаминов и гормонов.
Тема 5.3. Химическая природа, биосинтез, секреция и
Катаболизм гормонов.
Качественные реакции, подтверждающие белковую природу инсулина
Ход определения. 1. Биуретовая реакция. К 1 мл раствора инсулина добавляют 5-6 капель раствора гидроксида натрия и 1-2 капли раствора сульфата меди (2), перемешивают. Жидкость окрашивается в розово-фиолетовый цвет.
2. Реакция Миллона. К 5-10 каплям раствора инсулина добавляют 2-3 капли реактива Милона и осторожно нагревают. Образуется осадок в виде сгустка красного цвета.
3. Реакция Фоля. К 5-10 каплям раствора инсулина (использовать неразбавленный препарат) добавляют 2-3 мл раствора NaOH и кипятят 10 мин на маленьком пламени горелки. После охлаждения добавляют 1-2 капли раствора Pb(ONa)2 - появляется бурое окрашивание.
Примечание. Раствор Pb(ONa)2 приготовить в отдельной пробирке. Для этого к одной капле раствора ацетата свинца добавляют по каплям 10%-ного гидроксида натрия до растворения образовавшегося осадка гидроксида свинца.
При стоянии или нагревании бурое окрашивание может усилиться до черного и может выпасть черный осадок.
Качественные реакции на адреналин
Ход определения. 1.Реакция с хлоридом железа (3). В пробирку вносят 3 капли раствора адреналина и 1 каплю 1%-ного раствора хлорида железа (3). Появляется изумрудно-зеленое окрашивание, которое затем при добавлении 1 капли раствора гидроксида натрия приобретает вишнево-красный цвет. Реакция обусловлена тем, что пирокатехиновое ядро образует с ионами железа (3) соединения типа фенолятов.
2. Диазореакция на адреналин. В пробирку вносят 2-3 капли раствора адреналина, 2 капли раствора KIO3 и 2 капли раствора уксусной кислоты. Перемешивают и слегка нагревают. Жидкость окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена тем, что при взаимодействии адреналина с диазореактивом образуется азокраситель.
К методическим рекомендациям
ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ
НА ПРАКТИЧЕСКИХ ЗАНЯТИЯХ
Раздел V. Биохимия витаминов и гормонов.
Тема 5.4. Механизм действия гормонов. Гормональная регуляция
Обмена углеводов и липидов.
٭Количественное определение малонового диальдегида
Свободными радикалами (R*) называют атомы, молекулы или структурные фрагменты молекул, имеющие на внешних орбиталях неспаренные электроны. В силу исключительно высокой реакционной способности радикалы могут взаимодействовать с различными молекулами, вызывая их повреждение. Малоновый диальдегид (МДА)― конечный продукт свободно-радикального окисленияполиненасыщенных высших жирных кислот, входящих в состав фосфолипидов биологических мембран. МДА - химически очень активное вещество: его альдегидные группы взаимодействуют с NH2-группами белков, вызывая необратимую денатурацию последних.
Активация в клетке пероксидных и свободно-радикальных процессов ― это один из факторов патогенеза атеросклероза, ишемической болезни сердца, инфаркта, инсульта, язвенной и ожоговой болезни, онкологических, воспалительных и инфекционных заболеваний, синдрома адаптационного перенапряжения и хронической усталости, диабета. Синдром пероксидации проявляется так же при низком уровне антиоксидантов, стрессе любого происхождения, действии синтетических лекарств и ксенобиотиков, гиподинамии, старении организма, избыточном потреблении в пищу жиров и углеводов, гипоксических состояниях, воздействия вибрации, электромагнитных полей, радиоактивного и ультрафиолетового излучений.
Цель работы. Определить содержание МДА в сыворотке крови.
Принцип метода. МДА реагирует с тиобарбитуратовой кислотой, при этом образуется окрашенное соединение – триметиловый комплекс. Оптическую плотность окрашенного раствора определяют на ФЭК при 532 нм и рассчитывают концентрацию МДА, исходя из молярного коэффициента экстинции триметилового комплекса.
Ход определения. Студентам выдается готовый лизат, приготовленный следующим образом: к 2 мл крови добавляют 0,2 мл 0,1%-ного раствора Тритон Х-100 и оставляют на 30 мин при 0°С. МДА определяют в образовавшемся лизате по нижеприведенной схеме:
| № | Реактивы и этапы | Пробы | |
| Опыт | Контроль | ||
| Лизат, мл | 0,5 | ― | |
| Физиологический раствор, мл | 1,5 | ||
| Трихлоруксусная кислота (30%-ный раствор), мл | |||
| Инкубируют 15 мин при 0°С | |||
| Центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин | |||
| Надосадочную жидкость аккуратно сливают в помеченные стеклянные пробирки, отбирают из них точно по 2 мл надосадочной жидкости и добавляют: | |||
| Тиобарбитуратовая кислота (0,5%-ный раствор), мл | |||
| Кипятят 15 мин (осторожно!) | |||
| Охлаждают до 15-25°С | |||
| Фотометрируют против воды (λ=532 нм, толщина кюветы 1 см). D532 | |||
| Dоп―Dк |
Расчеты
Концентрацию МДА (Сх) вычисляют по формуле:
Cx=76,92•(Dоп―Dк) (мкмоль/л)
Примечание. Величина 76,92 рассчитывается исходя из молярного коэффициента экстинкции триметилового комплекса (1,56·105 М-1см-1) и разведения.
К методическим рекомендациям