Методы выделения клеточных компонентов

1. Схема выделения жгутиков: целые микробные клетки со жгутиками – встряхивание с бусами в течение 5 мин – центрифугирование при 8000/30 мин. –осадок (целые клетки) удаляют— в надосадочной жидкости находятся жгутики (жгутиковые антигены).

2. Схема выделения капсульной фракции: целые микробные клетки с капсулами – добавляют дистиллированную воду – центрифугируют при 5000/15 мин – осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и встряхивают без бус при 3000 колебаний/мин 15 мин – центрифугируют при 10000 об/мни 20 мин – осадок удаляют – в надосадочной жидкости находится капсульная фракция.

3. Схема выделения клеточных стенок: целые микробы – встряхивание с бусами 15 мин – центрифугирование при 5000 об/мин 20 мин – осадок удаляют (неразрушенные клетки) – в надосадочной жидкости находится фракция стенок бактерий.

4. Извлечение соматических антигенов из микробных клеток осуществляется также различным химическими способами: экстрагированием трихлоруксусной кислотой, кислотным гидролизом или ферментативным перевариванием бактерий с последующим осаждением антигена спиртом или сернокислым аммонием и очисткой диализом.

5. Схема получения экзотоксинов: культивирование токсин-продуцирующих бактерий в жидкой питательной среде до максимума продукции токсина – фильтрация для удаления бактериальных тел – перевод токсина в анатоксин путем длительного воздействия на него формалина при температуре 30-40° С.

Выделенные фракции (субфракции) антигенов из тех или других анатомических структур бактериальных клеток используют для получения специфических сывороток, а они, в свою очередь, применяются для сероидентификации и серотипирования культур, выделенных, от больных или из объектов внешней среды. Многие макромолекулярные соединения микробных клеток являются антигенами, но только часть из них называют иммуногенами, т. е. способными вызвать образование антител — антитоксинов или сенсибилизированных лимфоцитов, принимающих участие в создании иммунитета. Поверхностные структуры бактерий (жгутики, капсула и клеточные стенки) значительно более антигенны, чем внутриклеточные компоненты (цитоплазма, в частности, рибосомы, ДНК). Иммуногенные фракции находятся у большинства бактерий в капсуле (микрокапсуле) и клеточной стенке. Оказалось, что изолированные физическими способами клеточные структуры более иммуногенны, чем извлеченные химическими методами комплексы. В процессе химической экстракции более значительно повреждается исходная молекулярная организация биополимера, нарушается его нативная структура, в результате чего изменяются антигенные, в том числе иммуногенные свойства извлеченного комплекса. Внутриклеточные компоненты (цитоплазма, цитомембраны, генофор), где локализованы неспецифические антигены, обладают очень низкой иммуногенностью.

Помимо получения антигенов из отдельных анатомических структур часто возникает необходимость использования бактерий, как комплекса антигенов. Схема получения корпускулярного бактериального антигена: посев бактерий на плотную оптимальную питательную среду и культивирование в течение суток — смыв культуры физиологическим раствором — прогревание взвеси бактерии при температуре 60° С (для неспоровых бактерий) в течение 1 часа — стандартизация взвеси по стандартам мутности Государственного института стандартизации и контроля (ГИСК) медицинских биологических препаратов. Стандартизацию проводят оптическим методом, т. е. путем сравнения степени мутности взвеси бактерий с готовыми стандартами. Стандарты выпускаются густотой 500 млн., 1—1,5—2 млрд. микробных тел в 1 мл. Для определения густоты полученной взвеси 1 мл ее наливают в пустую пробирку, равную по диаметру со стандартом. Мерной пипеткой доливают физиологический раствор до тех пор, пока не исчезнет разница между густотой взвеси в этой пробирке и в стандарте на 1 млрд. Густота исходной взвеси бактерий выражается в млрд/мл и равна общему объему жидкости в рабочей пробирке. Исходную взвесь разводят до нужной концентрации бактерий. Определение количества бактерий во взвеси проводится также и нефелометрическим методом. В его основе лежит определение светорассеяния (мутности), вызываемого суспензией микробов. Количество света, рассеиваемое этой суспензией, пропорционально числу и размерам клеток при данной длине волны. Разность интенсивности света, падающего на кювету с микробной взвесью и прошедшего через него, по калибровочной кривой переводится в абсолютное количество бактерий. Данный метод может быть использован только для тех микробов, которые в жидких средах дают равномерное помутнение. а сама среда должна быть оптически прозрачной. Другие виды микроорганизмов (риккетсии, микоплазмы, грибки, простейшие, вирусы) имеют свои особенности антигенного состава, но общая характеристика свойств их антигенов остается той же, что и у бактерий (макромолекулярность, наличие антигенных детерминант и т. д.). С целью создания приобретенного искусственного активного иммунитета (человеку) или с целью получения сывороток (животному) вводят антигены (иммуногены) в очищенном виде, в составе убитых или живых микроорганизмов. Это введение редко бывает однократным, а чаще двух- или трех- и многократным по специальным схемам. Для получения сывороток и иммуноглобулинов от животных применяются схемы введения антигенов, в которых предусмотрены дозы, кратность, интервалы между введениями, метод введения (схемы гипериммунизации), а также возможность использования одного из адъювантов.

Адъювантами называют группу веществ как антигенной, так и неантигенной природы, относящихся к различным химическим соединениям и имеющим различное происхождение, которые при введении совместного с антигеном в организм животных и человека оказывают неспецифическое стимулирующее действие на формирование иммунного ответа. К ним относятся вещества неорганической природы: минеральные коллоиды (гидрат окиси алюминия, фосфат кальция, гидрат окиси железа), растворимые соединения (алюмо-калиевые квасцы, хлористый кальций); вещества органической природы: белки (протамины, желатин), липиды (животные, растительные масла и жиры), углеводы (крахмал, танин, пектиновые вещества), сложные вещества (адъювант Фрейнда, комплексы липидов с минеральными сорбентами). Наиболее полно действие адъювантов выявляется при первом соприкосновении организма с антигеном (грундиммунизация), но при последующих инъекциях антигена с адъювантом его стимулирующее действие заметно снижается.

Антитела

Антитела представляют собой белки глобулиновой природы (иммуноглобулины) образующиеся в организме под воздействием антигена и обладающие способностью избирательно связываться с ним. Существуют пять разновидностей молекул (классов) иммуноглобулинов с молекулярной массой от 150 до 900 тыс. дальтон: IgM, lgG, IgA, IgE, IgD. Молекулы иммуноглобулинов состоят из двух легких (L) и двух тяжелых (Н) полипептидных цепей, соединенных между собой дисульфидными связями (рис. 33). Оба типа цепей, соединенных между собой, обладают антигенностью. У тяжелых цепей она специфична для каждого класса иммуноглобулинов и соответственно классам Н-цепи обозначаются m, g, a, e, s. Легкие цепи в антигенном отношении делятся на две разновидности — À и l, одинаковые для, разных классов. Антигенные различия тяжелых цепей используют для получения антисывороток, позволяющих выявить наличие в исследуемом материале иммуноглобулинов того или иного класса. Легкие цепи IgG состоят из двух участков (доменов): вариабельных (VL) и константных (CL). Тяжелые цепи включают в себя один вариабельный (VН) и 3 константных участка (CH₁, CH₂, СН₃). Вариабельные участки легких и тяжелых цепей формируют активные центры антител (VL –VH). Участок CL – CH₁ определяет небольшие различия в последовательности расположения аминокислот у индивидуумов одного и того же вида (аллоантигенные различия молекул IgM). Область СН₂–СН₂ участвует в фиксации и активации комплемента, а область СН₃–СН₃ – в фиксации антитела к клеткам (лимфоцитам, макрофагам, тучным клеткам). Данный тип строения молекулы характерен и для всех остальных классов иммуноглобулинов, различия заключаются в дополнительной организации этой основной единицы. Так, Н-цепь IgM состоит не из 4, а из 5 доменов, а вся молекула IgM представляет собой пентамер молекулы IgG, соединенный дополнительными полипептидными J-цепями. IgA может быть в форме мономеров, димеров и секреторного IgA. Последние две формы имеют дополнительные (димеры) J или J и S цепи (секреторный). Другие свойства антител представлены в таблице 13.

Молекула антитела связывается с детерминантой антигена не целиком, а лишь определенной своей частью, называемой активным центром. Активный центр представляет собой полость или щель, соответствующую пространственной конфигурации детерминантной группы антигена. Один из активных центров по разным причинам может быть функционально инертным. Такие антитела называются неполными. Их появлению обычно предшествует образование полных, т. е. антител с двумя (IgG) активными центрами. Неполные антитела встречаются у разных классов иммуноглобулинов.

Рис. . Структура молекулы IgG с указанием мест расщепления на фрагменты 2-меркапэтанолом, папаином и пепсином.

Основная масса антител образуется в клетках плазмоцитарного ряда (плазмобласт, проплазмоцит, плазмоцит). Каждая из них продуцирует антитела только одной специфичности, т. е. к одной антигенной детерминанте.

Таблица 13

Основные характеристики иммуноглобулинов человека

№ п/п	Показатели	IgM	IgG	IgA	IgE	IgD
1.   2. 3. 4. 5. 6.   7. 8. 9.	Молекулярная масса   Уровень в крови в г/л Тип тяжелых цепей Формула Фиксация С Нейтрализация токсинов Агглютинация Бактериолиз Прохождение плаценты	900т.   0,5 – 1,8 m1 - m2 5H5L ++++ +   + + –	150т.   6 –16 g1 - g4 2H2L ++ +   + + +	170т. и 300т. 1 – 5 a1 - a2 4H4L +S +   + ? –	190т.   0,00002 e 2H2L – –   – – –	180т.   0,03 – 0,04 s 2H2L – –   – – –

Территориально эти клетки располагаются в селезенке, лимфоузлах, костном мозге, лимфоидных образованиях слизистых оболочек.

При первичном контакте организма с антигеном и антителообразовании различают индуктивную и продуктивные фазы. Продолжительность первой фазы составляет около 2 суток. В этот период происходит пролиферация и дифференцировка лимфоидных клеток, развитие плазмобластической реакции. Вслед за индуктивной наступает продуктивная фаза. В сыворотке крови антитела начинают определяться с З-го дня после контакта с антигеном. Эти антитела относятся к классу IgM. С 5–7 дня происходит постепенная смена синтеза IgM на синтез IgG той же специфичности. Обычно к 12—15 дню кривая антителообразования достигает максимума, далее уровень антител начинает снижаться, но определенное их количество можно обнаружить и через много месяцев, а иногда и лет. При повторном контакте организма с тем же антигеном индуктивная фаза занимает лишь несколько часов. Продуктивная фаза протекает быстрее и интенсивнее, осуществляется синтез преимущественно IgG.

Для выделения и очистки молекул иммуноглобулинов применяют хроматографический и электрофоретический методы с предшествующим первичным фракционированием исходной многокомпонентной смеси (сыворотки крови человека, иммунизированного животного) путем избирательного осаждения молекул одного или нескольких видов.

Фракционирование осаждением основано на различной растворимости биополимеров (глобулинов) в водных растворах, которая определяется наличием и соотношением гидрофобных и гидрофильных группировок в их структуре. Белки, несущие на поверхности значительное количество гидрофобных аминокислотных остатков, например глобулины, плохо растворимы в водной среде с низкой ионной силой, а белки, характеризующиеся низкой гидрофобностью (альбумины), обладают высокой растворимостью в воде. С увеличением ионной силы раствора, в котором находятся глобулины, их растворимость повышается, однако по достижении определенного предела концентрации они начинают агрегировать и выпадать в осадок. Происходит солевое осаждение молекул — высаливание. Так как глобулины разных классов отличаются друг от друга по характеру растворимости при высоких концентрациях соли, то постепенно увеличивая ионную силу раствора, в котором находятся различные молекулы, можно последовательно перевести их в нерастворимое состояние — высолить. Эффективными солями для осаждения иммуноглобулинов являются сульфаты и фосфаты, цитраты натрия, калия и аммония. Из органических растворителей для фракционирования иммуноглобулинов больших размеров чаще всего используют этанол и риванол. В последние годы для осаждения сывороточных белков используют водорастворимые полимеры — полиэтиленгликоль и сульфат декстрана. Так, для осаждения IgM применяют 6% концентрацию полиэтиленгликоля, для осаждения IgG — 12% и для осаждения IgA — 14% концентрацию.

Отдельные глобулины, перешедшие под воздействием различных реагентов в нерастворимое состояние, представляют собой достаточно крупные агрегаты, которые можно отделить от раствора фильтрованием. В современных биологических исследованиях широко используют фильтры из стекловолокна, асбеста, нитроцеллюлозы, ацетатцеллюлозы, целлюлозы, тефлона, нейлона, капрона, поливинилхлорида и др.

Полученные фракции иммуноглобулинов обычно подвергают более тонкой очистке хроматографией или электрофорезом. К настоящему времени разработаны различные виды. хроматографии, среди которых наиболее распространены гель-фильтрация, ионообменная и аффинная. Существует множество приемов применения каждого из видов хроматографии — колоночная, в тонких слоях и т. д. Гранулами набухшего в каком-либо растворителе геля с пористой структурой наполняют колонки, наслаивают сверху на столб геля осажденную фракцию иммуноглобулинов с разными молекулярными массами и пропускают их через гель. Поскольку гранулы геля имеют пористую структуру, то часть молекул, размеры которых меньше величины пор, проникают в гранулы и мигрируют определенное время в их сетчатой структуре. Молекулы, размеры которых больше величины пор, не проникают в гранулы, а, огибая их, продвигаются быстрее. В результате молекулы глобулинов элюируются из хроматографической колонки поочередно — в порядке уменьшения их молекулярных масс. Субфракции глобулинов с разной молекулярной массой собирают раздельно. Для гельфильтрации применяют три вида гранулированных гелей: декстрановые (сефадекс типов от G-10-грубый до G-200-сверхтонкий), агарозы (сефарозы) полиакриламидные (биогели, акрилексы). В основе метода ионообменной хроматографии лежит применение носителей, состоящих из нерастворимой основы (гели декстрана, агарозы, полиакриламида) с фиксированными на ней функциональными группами (сульфометильными, сульфоэтильными, сульфопропильными, карбоксиметильными или карбоксиэтильными и др. катионов). При пропускании через ионообменник с положительно заряженными, функциональными группами (катионообменник) смеси глобулинов, имеющих отрицательный, заряд, последние свяжутся с ними. Связавшиеся глобулины отличаются между собой изоэлектрическими точками, и их можно затем в определенной последовательности элюировать из ионообменника. Принцип иммуноаффинной хроматографии заключается в том, что на носителе (агароза, целлюлоза, гели сефадекса или полиакриламида, бентонит и др.) сорбируют функционально активные молекулы антигенов. При пропускании через такой иммуносорбент фракций иммуноглобулинов произойдет образование комплекса носитель-антиген-иммуноглобулин. В последующем комплекс диссоциируют для получения чистой фракции иммуноглобулина. Иммуносорбент используют многократно.

Разделение классов глобулинов проводят также с использованием метода электрофореза, так как их электрофоретическая подвижность различна.