Факторы и механизмы неспецифической противоинфекционной

Защиты

А. Клеточные факторы и методы определения их активности.

Способность вступать во взаимодействие с микроорганизмом и реагировать на него как на фактор, нарушающий нормальные физиологические функции, характеризует общую физиологическую реактивность организма.

Восприимчивость макроорганизма зависит от места заражения (входные ворота), через которые проникают возбудители.

Попадание в макроорганизм микроорганизма-паразита включает сложную цепь защитно-приспособительных реакций, направленных в конечном итоге на устранение возбудителя и восстановление структуры органов и систем организма. Защитные реакции макроорганизма, мобилизируемые при развитии инфекционного процесса, обеспечивают химическое постоянство внутренней среды организма, его генетического и антигенного состава (гомеостаз) и являются частным вариантом адаптивной реакции организма на действие любого повреждающего фактора.

Сопротивляемость организма зависит от непроницаемости нормальных кожных и слизистых покровов для большинства микроорганизмов, наличия бактерицидных субстанций в кожных секретах, кислотности содержимого желудка, присутствия в крови и других жидкостях организма (слюна, слеза и др.) таких ферментных систем, как лизоцим, пропердин и др., от количества и активности фагоцитов крови и тканей.

Все эти факторы являются неспецифическими, формируются в пренатальном периоде онтогенеза, они генетически детерминированы. От момента рождения и до естественной смерти макроорганизма (постнатальный период онтогенеза) их функциональная активность постоянно меняется либо в силу возрастных особенностей, либо вследствие воздействия многообразных внешних факторов (физических, химических, биологических, психотропных и др.). В каждый конкретный момент жизни человека совокупность этих факторов определяет степень резистентности его организма. Их биологическая роль заключается в том, чтобы в ходе начавшегося инфекционного процесса воспрепятствовать развитию инфекционного заболевания.

Наиболее изученные неспецифические факторы защиты можно разделить на клеточные (кожа, слизистые, лимфатические узлы, воспаление, фагоцитоз) и гуморальные (b-лизины, лизоцим, комплемент, пропердин).

Кожа

Важным фактором неспецифической резистентности является функция кожи как механического барьера для внедрения паразита. Отторжение верхних слоев эпидермиса, секреты сальных и потовых желез способствуют их удалению с поверхности кожи. Существенную роль в элиминации микробов с поверхности кожи играют различные микробоцидные субстанции (молочная и жирные кислоты и др.), обеспечивающие се «самоочищение». Поэтому различные микроорганизмы, не являющиеся ее постоянными обитателями, не могут в течение продолжительного времени сохраняться на коже. Бактерицидность кожных секретов зависит от их кислотности.

Для определения бактерицидной активности кожи суточную бульонную культуру кишечной палочки (1:50000) наносят на внутреннюю поверхность предплечья и распределяют равномерно шпателем. Делают отпечаток на предметное стекло со средой Эндо с одного участка исследуемой кожи, а через 15 минут – со смежного. Инкубируют посевы 18—24 часа при 37°С и подсчитывают колонии на 3 см² поверхности каждой пластины.

Индекс бактерицидности (ИБ) вычисляют по формуле:

где K₁ — количество колоний сразу после нанесения на кожу, К₂ — количество колоний через 15 минут после контакта. У здоровых людей индекс бактерицидности равен 90—100 %.

Слизистые оболочки

Для большинства микроорганизмов слизистые оболочки разных органов являются барьером, препятствующим проникновению внутрь организма. Проницаемость слизистых оболочек для микробов зависит от физиологического состояния макроорганизма и биологической активности данного вида или штамма микробов.

На слизистой оболочке патогенные микроорганизмы не имеют оптимальных условий для размножения в связи с бактерицидным действием тканей и секретов, смыванием слюной и др., поэтому в естественных условиях размножение их замедляется.

Лимфатические узлы

Барьером для большинства микроорганизмов являются лимфатические узлы, а также скопления лимфоидных клеток в различных внутренних органах. В лимфоидной ткани, благодаря действию клеточных факторов (цитотоксический эффект, фагоцитоз и др.) происходит фиксация и гибель значительной части или всех возбудителей.

Наиболее богаты лимфатическими сосудами кожа и слизистые оболочки пищевого канала и дыхательного аппарата. При повреждении кожи и слизистых оболочек находящиеся на их поверхности микробы проникают в лимфатические сосуды и током лимфы доставляются в лимфатические узлы, которые являются своеобразным биологическим фильтром для возбудителей, переносимых с лимфой.

Воспаление. Фагоцитоз

При воздействии на организм многообразных повреждающих факторов физической, химической и биологической природы возникает сложная неспецифическая защитно-приспособительная реакция организма — воспаление. Воспаление — местная реакция кровеносных сосудов, соединительной ткани и нервной системы на повреждение. В процесс воспаления вовлекаются лимфатические структуры, сосудистая сеть и локально повреждаемые ткани. Сначала нарушается обмен жидкости, что ведет к нарушению циркуляции в капиллярах. Одно из серьезных изменений — повышение проницаемости капилляров.

Итогом воспалительной реакции является локализация микроорганизмов (или отграничение вызванного ими очага поражения) с последующей их элиминацией и частичным или полным восстановлением нарушенных структур.

Первым звеном воспалительной реакции являются сосудистые изменения, выражающиеся прежде всего в повышении проницаемости стенки сосудов, связанной, главным образом, с действием биологически активных веществ (гистамин, серотонин, кинины), выделяющихся при повреждении клеток, особенно тучных. Повышение сосудистой проницаемости ведет к периваскулярной экссудации плазмы («серозный отек») и обусловливает миграцию клеток-фагоцитов (нейтрофилы, макрофаги) в пораженные участки ткани.

Указывают на роль воспалительного отека (скопление экссудата в воспалительной ткани) как фактора, способного связывать, фиксировать бактериальные токсины в очаге воспаления и не допускать их всасывания и распространения в организме. Особенно большое защитное значение имеют фагоцитарная и пролиферативная функции клеток – гистиоцитов, макрофагов. Грануляционная ткань, которую они образуют, представляет мощный защитный барьер против инфекции.

Фагоциты могут быть причислены к главным факторам воспаления. Особую роль при этом играют тканевые макрофаги, обладающие способностью поглощать и переваривать различные чужеродные для организма агенты, включая микроорганизмы. Защитные свойства фагоцитов связаны с наличием в их цитоплазме большого числа лизосом - органелл, богатых различными гидролитическими ферментами, обеспечивающими расщепление значительного числа химических связей. Процесс фагоцитоза нередко сопровождается гибелью клетки-фагоцита, однако при этом происходит гибель большого числа микроорганизмов.

Фагоцитоз — общебиологическое неспецифическое явление, которое может быть отнесено филогенетически к высокому уровню распознаваемости чужеродности. Фагоцитирующие клетки мезенхимы приобрели в процессе эволюции определенную специализацию и стали поглощать широкий спектр посторонних частиц, таких, как микроорганизмы, макромолекулярные комплексы aнтиген-антитело, клетки и их органеллы, вирусы, коллоидальные растворы красок и др. Важнейшее свойство фагоцитов состоит в их способности распознавать «не свое», что ставит, эту реакцию на переходную ступень между неспецифической резистентностью н специфическим иммунитетом.

Клетки, обладающие способностью к фагоцитозу и пиноцитозу, подразделяют на две основные категории фагоцитов — мононуклеарные и полинуклеарные («макрофаги» и «микрофаги» по И. И. Мечникову).

Процесс фагоцитоза протекает в несколько ступеней. На первой стадии распознавания основную роль играет клеточная мембрана, которая благодаря своим рецепторам (Fc—рецепторы) обеспечивает контакт с объектом фагоцитоза. Погружение чужеродной частицы внутрь макрофага связано со сложными изменениями физико-химических свойств его цитоплазмы. Вначале актиноподобный белок макрофага полимеризуется, а затем полимеры сокращаются под действием миозина с кофактором. В итоге образуются псевдоподии, захватывающие фагоцитируемую частицу. Фагоцитирующая вакуоль (фагоцитируемый агент, окруженный плазматической мембраной фагоцита и погруженный внутрь цитоплазмы) соприкасается с лизосомальными гранулами фагоцита. При слиянии вакуоли с лизосомами образуется фаголизосомальная (пищеварительная) вакуоль. Через непродолжительное время в вакуоли может наступить гибель захваченной частицы (например, бактерии). Этому способствуют метаболиты фагоцита и лизосомальные ферменты (завершенный фагоцитоз).

Микробоцидную деятельность осуществляет молочная кислота, образующаяся в результате гликолиза и понижающая внутривакуольный рН до 4,0, затем перекись водорода, являющаяся результатом окисления никотиндиамид-адениннуклеотида в редуцированном фосфорилированном состоянии. Лизосомы содержат в себе более тридцати различных ферментов, способных гидролизировать большую часть захваченных объектов. В гранулах лейкоцитов найдены и другие микробоцидные вещества, например, катионные белки, лактоферрин, различные пероксидазы, активные также в отношении и вирусов.

Однако, не во всех случаях происходит гибель, а ряд возбудителей могут даже размножаться в фагоците и погубить его (незавершенный фагоцитоз).

Доступность клеток для определения фагоцитарной активности микрофагального (нейтрофилы) или макрофагального (моноциты) фагоцитоза представлена на схеме 1.

Схема 1. Локализация фагоцитирующих клеток и их доступность для исследования.

Костный мозг	Кровь	Ткань
	Палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы     Моноцит	Нейтрофилы воспалительного очага     Тканевой макрофаг

Для оценки фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови к цитратной крови, взятой из пальца, в объеме 0,2 мл, добавляют 0,25 мл взвеси микробной культуры с концентрацией 2 млрд. микробов в 1 мл. Смесь инкубируют 30 мин при 37°С, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5-6 мин, удаляют надосадочную жидкость. Осторожно отсасывают тонкий серебристый слой лейкоцитов, готовят мазки, сушат, фиксируют, красят краской Романовского-Гимза. Препараты сушат и микроскопируют.

Подсчет поглощенных микробов ведут в 200 нейтрофилах (50 моноцитов). Интенсивность реакции оценивают по следующим показателям:

1. Фагоцитарный показатель (фагоцитарная активность) — процент фагоцитов из числа сосчитанных клеток.

2. Фагоцитарное число (фагоцитарный индекс) — среднее число микробов, поглощенное одним активным фагоцитом.

Для определения переваривающей способности лейкоцитов периферической крови готовят смесь взятой крови и суспензии микроорганизма и выдерживают в термостате при 37°С 2 часа. Приготовление мазков аналогично. При микроскопии препарата жизнеспособные микробные клетки увеличены в размерах, переваренные же менее интенсивно окрашены, меньших размеров. Для оценки переваривающей функции используют показатель завершенности фагоцитоза – отношение количества переваренных микробов к общему числу поглощенных микробов, выраженное в процентах.

Для оценки активности фагоцитоза используют также тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).

Принцип метода основан на восстановлении поглощенного фагоцитом растворимого красителя (нитросинего тетразолия) в нерастворимый диформазан. НСТ-тест интегрально характеризует кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцита.

В две пробирки, содержащие по 0,05 мл раствора гепарина, вносят по 0,1 мл крови и после перемешивания в одну из них добавляют 0,05 мл суспензии зимозана, а в другую — 0,05 мл раствора Рингера, затем в обе пробирки вносят по 0,05 мл раствора нитросинего тетразолия и инкубируют в водяной бане при 37°С 30 мин, встряхивая каждые 10 мин. После инкубации содержимое перемешивают, делают мазки, фиксируют, окрашивают красителем для НСТ-теста, нанося на стекла 5-7 капель красителя на 1,5 мин, добавляют такое же количество дистиллированной воды. Выдерживают в течение 30 мин, промывают.

При микроскопии препаратов в каждом случае подсчитывают 100 нейтрофилов (25 моноцитов), среди которых выделяют процент клеток, содержащих отложения диформазана (НСТ-позитивные), далее подсчитывают индекс активизации нейтрофилов (моноцитов) по формуле:

где А - количество клеток, не содержащих диформазановых отложений или содержащих их в виде пылевидных немногочисленных включений;

В - количество клеток, в которых площадь отложения диформазана, не превышает 1/3 площади ядра; С -количество клеток, в которых названные отложения занимают oт 1/3 до всей величины площади ядра; Д — количество клеток с диформазановыми включениями по площади превосходящими площадь ядра.

Активность фагоцитоза обусловлена не только набором его лизосомальных ферментов и синтезируемых ими веществ, но и состоянием проницаемости лизосомной мембраны. Устойчивость к фагоцитозу определяется поверхностными свойствами микробной клетка, наличием факторов типа лейкотоксинов и антифагинов, инактивацией биоксидантов и пр.(Табл. 9)

Таблица 9.

Интенсивность реакции фагоцитоза для человека (норма, нейтрофилы)

Показатели	Дети	Взрослые
Фагоцитарный показатель в % Фагоцитарное число Показатель завершенности фагоцитоза в % НСТ-тест (индекс активности нейтрофилов)	0,1 – 0,15	75-80 14-15 55-60 0,1 – 0,15

Гуморальные факторы и методы их определения

Наряду с клеточными реакциями неспецифической резистентности в процессе эволюции возник ряд веществ, находящихся в коллоидно-растворимом состоянии или же выделяющихся в жидкие среды организма. Эти вещества осуществляют функцию первичной защиты от чужеродных антигенных и неантигенных частиц.

Количество этих гуморальных факторов значительно. К числу более активных, или наилучшим образом изученных, следует отнести нормальные антитела, лизоцим, комплемент, пропердин, лейкины, b-лизины и др.

Нормальные антитела

В сыворотке людей и животных выявляются нормальные антитела против различных микробных антигенов. Они обладают агглютинирующим, комплементсвязывающим, литическим, нейтрализующим влиянием на микробные антигены. Вопрос о природе так называемых неспецифических иммуноглобулинов сыворотки до сих пор не решен. Между тем сыворотка крови может содержать иммуноглобулины даже по отношению к антигенам, о которых заведомо известно, что они никогда не поступали в данный организм. Такие антитела получили название естественных или «нормальных». Они обычно определяются в низких титрах, однако их иммунологическая роль довольно выражена, особенно по отношению к инфекционным агентам.

Считается, что нормальные антитела появляются в результате так называемой неприметной иммунизации возбудителями или антигенами, поступающими с пищей, однако нельзя отрицать и спонтанный (генетически обусловленный) механизм их образования.

Реакции антител по отношению к антигенам, о которых заведомо известно, что они не проникали в данный организм, могут расцениваться и как перекрестные, отсюда и их более низкие титры. Нормальные антитела могут поступать трансплацентарно или с молоком матери. Их титр определяется серологическими реакциями (РНГА, РСК и др.) и обычно равен. 1:5 — 1:20.

B-лизины

Многие сыворотки проявляют бактерицидное действие по отношению к грамположительным, главным образом, спорообразующим бактериям и микрококкам. Эта активность не связана с комплементом и сохраняется после прогревания сыворотки при 60—65 °С в течение 30 мин. Характерно, что b-лизины обнаруживаются в сыворотке после образования свернутого сгустка цельной крови и не обнаруживаются в плазме. Считается, что b-лизины выделяются в процессе свертывания крови тромбоцитами.

Бактерицидное действие b-лизинов, по-видимому, обусловлено их влиянием на цитоплазматическую мембрану, в результате чего наступает аутолиз клеточной стенки ферментами цитоплазматической мембраны. b-лизины активны только в присутствии ионов Са⁺⁺.

Для определения b-лизинов в нормальной сыворотке человека необходима спорообразующая культура сенной палочки. 'Готовят микробную взвесь, добавляют к 0,4 мл взвеси 0,2 мл исследуемой сыворотки. В контроле к 0,4 мл взвеси добавляют 0,2 мл физиологического раствора. Замеряют оптическую плотность опытной и контрольной пробирок, помещают в термостат при 37 °С на 2 часа. Вновь замеряют оптическую плотность. Расчет активности b-лизинов проводят по формуле:

где Д₁ и Д₂ – оптическая плотность в опыте до и после инкубации.

Для определения титра b-лизинов готовят разведения исследуемой сыворотки в мясо-пептонном бульоне. Затем во все пробирки добавляют взвесь суточной культуры сенной палочки, инкубируют в термостате 24 часа. Определяют титр b-лизинов – наибольшее разведение сыворотки, давшее полный лизис тест-культуры.

Комплемент

Комплемент представляет собой систему сывороточных белков. Известно не менее 18 белков, составляющих систему комплемента. Восемь из них являются индивидуальными белками, а один представляет комплекс: 4 белка системы пропердина, один — ингибитор фермента активатора. Согласно номенклатуре, принятой ВОЗ, система комплемента обозначается символом С, а ее индивидуальные компоненты символами Cl, C2 и т. д.

Каждая белковая фракция обладает определенными свойствами. Комплемент находится в сыворотке крови различных животных и человека, но наибольшее его количество обнаружено в сыворотке крови морских свинок, поэтому в практике препарат «комплемент» отождествляется с сывороткой морской свинки. В норме фракции комплемента находятся в неактивном состоянии. Они становятся активными в процессе многоступенчатых превращений, разделяемых на классический и альтернативный пути активации.

При классическом пути начальным активатором комплемента является комплекс антиген-антитело. Активируют систему комплемента IgM и большинство подклассов IgG (IgG1, 3) в большей степени, IgG2 — в меньшей.

При альтернативном пути активаторами являются полисахариды, в том числе зимозан и инулин, липополисахариды (эндотоксины), агрегаты – IgA. Дальнейший ход активации аналогичен классическому пути. (Схема 2)

В активном состоянии комплемент участвует в специфических иммунологических реакциях организма, при бактериолизе, ускоряет специфическую агглютинацию, преципитацию, усиливает, фагоцитоз, участвует в реакциях нейтрализации.

Активированные компоненты комплемента действуют в определенном порядке — в виде каскада ферментов, при этом продукт предшествующей реакции служит катализатором для включения в последующую реакцию компонента и субкомпонента. Комплемент является важным фактором гомеостаза и регулируется механизмами последнего.

Комплемент отличается от иммуноглобулинов тем, что его концентрация в сыворотке крови не повышается в результате иммунизации.

Содержание и уровень комплемента в крови можно использовать как тест, характеризующий состояние естественной резистентности макроорганизма: высокое содержание комплемента в крови считается благоприятным признаком; снижение уровня комплемента является отрицательным прогностическим показателем.

Для определения титра комплемента исследуемую сыворотку разводят и добавляют гемолитическую систему (смесь равных объемов эритроцитов барана и гемолитической сыворотки).

Таблица 10

Схема титрования комплемента

Ингредиенты	пробирки
1. Исследуемая сыворотка (1:10), мл	0,05	0,1	0,15	0,2	0,25	0,3	0,35	0,4	0,45	0,5	–
2. Физ. раствор, мл	1,45	1,4	1,35	1,3	1,25	1,2	1,15	1,1	1,05	1,0	1,5
3. Гемолитическая система, мл	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5	1,5

Пробирки инкубируют при 37°С 30 минут, встряхивая каждые 10 минут (табл. 10). Для контроля готовят разведения эритроцитов и дистиллированной воды: 0,1мл + 2,9мл (соответствует 20% гемолизу); 0,25мл + 2,75мл (соответствует 50% гемолизу); 0,35мл + 2,65мл (соответствует 70% гемолизу).

После инкубации содержимое пробирки центрифугируют при 1500 об/мин 5 минут и определяют пробирку, соответствующую 50% гемолизу. Количество комплемента, внесенное в эту пробирку, делят на исходное разведение и узнают какое количество неразведенной сыворотки дает этот феномен. Эта величина будет соответствовать 1 единице СН₅₀. Вычисляют, сколько таких единиц будет в 1 мл неразведенной сыворотки.

Схема 2. Пути активации и физиологические функции компонентов

комплемента

Пропердин

В 1954 году Л. Пилломер обнаружил сывороточный фактор, который, как тогда считалось, активирует С₃ и является центральным звеном альтернативного пути активации комплемента. Он был назван пропердином. Вскоре были обнаружены еще два дополнительных сывороточных белка – В и D. Вместе с компонентами комплемента С₅ – С₉ они были объединены в пропердиновую систему. Действительная роль пропердина (Р) в альтернативном пути активации оказалась иной. Он является стабилизатором комплекса С_3ВВ (схема3).

Схема 3. Роль пропердина в альтернативном пути активации комплемента

Фактор В – протеиназа, Мм – 95 кD,

Фактор D – гликопротеин, Мм – 25 кD,

Фактор Р – g-глобулин, Мм – 220 кD.

Тем не менее, содержание пропердина в сыворотке крови в определенной степени, коррелирует с уровнем ее бактерицидной активности. В силу этого определение содержания пропердина в сыворотке крови больных продолжает использоваться в практике.

О количестве пропердина в испытуемой сыворотке судят по степени сорбции комплемента на комплексе зимозан-пропердин. Чем больше в сыворотке пропердина, тем интенсивнее будет связываться этим комплексом комплемент.

Методика: опыт ставится в двух пробирках. Опытная содержит испытуемую сыворотку, зимозан и комплемент. Контрольная — только испытуемую сыворотку и комплемент. Пробирки инкубируют при 37°С 60 мин. Далее в обеих пробирках по общепринятой методике титруют комплемент. Титр комплемента в контрольной пробирке показывает, какое количество комплемента было в опытной пробирке до образования комплекса пpoпердин-зимозан. Титрование же комплемента в опытной пробирке показывает какое количество осталось несвязанным после образования этого комплекса. По разнице полученных единиц можно судить о количестве комплемента, связанного комплексом пропердин—зимозан. За одну единицу пропердина принимается его количество, которое полностью связывает весь комплемент в 1 мл сыворотки.

Лизоцим

По химической структуре лизоцим относится к полипептидам, содержащим в молекуле около 130-160 аминокислотных остатков. Он растворим в слабокислой среде, устойчив к непродолжительному кипячению, к трипсину.

Лизоцим (мурамидаза) способен расщеплять основное вещество клеточной стенки бактерии муреин путем разрушения связи между первым углеродным атомом n-ацетилмурамовой кислоты и четвертым углеродным атомом n-ацетилглюкозамина, входящего в состав клеточной стенки бактерий. В результате этого изменяется ее проницаемость.

Лизоцим является мощным защитным фактором слизистой оболочки полости рта, глаза, содержится в слезах, слюне, крови, материнском молоке, тканях различных внутренних органов. Высокая концентрация лизоцима выявляется в околоплодных оболочках и водах плода.

Основная масса лизоцима синтезируется, по-видимому, тканевыми макрофагами и нейтрофилами.

Лизоцим выполняет в организме важные биологические функции: бактерицидное действие, стимулирующее воздействие на фагоцитоз, способность нейтрализовать некоторые микробные токсины, а также противовоспалительное действие.

Наибольший литический эффект лизоцим оказывает на культуру микрококка (in vitro). Действие лизоцима можно оценить фотометрически по уменьшению оптической плотности суспензии микрококка.

Методика. Готовят исходный раствор кристаллического лизоцима 100 мг/мл, а из него 9 различных разведений.

Все разведения как лизоцима, так и бактерий, делают на 1/15 М фосфатном буфере, рН=6,2 (табл. 11).

Для приготовления взвеси бактерий смывают буферным раствором со скошенного агара суточную культуру микрококка и стандартизируют его на ФЭК-М по левому барабану до оптической плотности 0,66.

Таблица 11

Схема титрования лизоцима

Ингредиенты	пробирки
1. Исследуемая сыворотка (1:10), мл	0,02	0,04	0,06	0,08	0,10	0,20	0,30	0,40	0,50	-
2. Физ. раствор, мл	0,48	0,46	0,44	0,42	0,40	0,30	0,20	0,10	-	0,5

В каждую пробирку с приготовленными разведениями лизоцима вносят по 2 мл взвеси микрококка и выдерживают при 37°С 30 мин в термостате. Замеряют оптическую плотность на ФЭК-М по правому барабану в кювете № 2 с зеленым светофильтром. На основе полученных данных строят калибровочную кривую.

Для определения количества лизоцима исследуемый материал в объеме 0,1 мл добавляют к 0,4 мл буфера и к полученной смеси приливают 2 мл стандартизованной смеси микрококка. Контролем является пробирка, не содержащая исследуемого материала. Инкубируют в термостате 30 минут при 37°С и на ФЭК-М определяют оптическую плотность в опытной и контрольной пробирках. По калибровочной кривой устанавливают концентрацию лизоцима в исследуемом материале.