Система антиген-антитело в диагностике инфекционных болезней
ЗАНЯТИЕ 1.3.4
СИСТЕМА АНТИГЕН-АНТИТЕЛО В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Цель:изучить механизмы взаимодействия АГ-АТ, принципы и методы постановки: РА, РПГА, РП.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:
1. РА. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.
2. РПГА. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.
3. РП. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:
использовать реакции иммунитета в диагностике инфекционных болезней.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:
о существовании различных модификаций серологических реакций, усиливающих их чувствительность (информативность).
Теоретические аспекты:
Серология - раздел иммунологии, изучающий взаимодействие Аг иАт в реакциях invitro.
Серологические методы - совокупность реакций invitro, основанных на Аг-Ат взаимодействии и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма Ат, а также Аг в исследуемом материале.
Сероиндикация- обнаружение возбудителя в исследуемом материале (определение рода возбудителя) с поливалентными сыворотками.
Сероидентификация - определение вида возбудителя или отдельных антигенов с монорецепторными сыворотками.
Серодиагностика - обнаружение антител или определение титра антител в сыворотке крови
Схема описания реакции:
Направление (цель)
Ингредиенты (компоненты)
3) механизм (схема)
Способ постановки реакции
Результат
Работа №1. Реакция агглютинации (РА)
Цель: Разобрать механизм, освоить различные методы постановки РА в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.
1.Самостоятельная работа.Поставить, учесть, оценить результат РА.Определить родовую принадлежность выделенной чистой культуры в ориентировочной РА на стекле с поливалентными сыворотками: сальмонеллезной ABCDE, шигеллезной, иерсиниозной (сероиндикация)(см. теоретическую справку)
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм:
Постановка:
Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Самостоятельная работа.Определить вид исследуемой культуры в развернутой РА на стекле с моновалентными сыворотками (сероидентификация). Поставить, учесть, оценить результат РА.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм (схема см. выше)
Постановка:
Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
1. Самостоятельная работа.Учесть результат РА с дизентерийнымдиагностикумом с целью выявления антител в парных сыворотках пациента (серодиагностика). Парные сыворотки - это сыворотки от одного и того же больного, взятые в начале болезни и через одну две недели с целью выявления нарастания титра антител. Сделать вывод.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм (см. выше)
Постановка:
1 неделя
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 КС КД
2 неделя
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Выполните задания для самоконтроля:
Агглютинация-_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Ингредиенты для постановки РА:
1.___________________________________________________________________________
2.___________________________________________________________________________
3.___________________________________________________________________________
Феномен реакции _____________________________________________________________
Работа №2. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА и РПГА синонимы)
Цель:Разобрать механизм, освоить метод постановки РПГА в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.
Самостоятельная работа. Учесть результат РПГА с эритроцитарнымсальмонеллезнымдиагностикумом для определения специфических АТ в парных сыворотках больного
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм:
Постановка:
1 неделя
1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 КС КД
2 неделя
Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Выполните задания для самоконтроля:
Ингредиенты для постановки РПГА:
1.___________________________________________________________________________
2.___________________________________________________________________________
3.___________________________________________________________________________
Феномен реакции_____________________________________________________________
Работа № 3. Реакция преципитации (РП)
Цель:Разобрать механизм, освоить метод постановки РП в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.
Самостоятельная работа.Поставить РП для выявления сибиреязвенного Аг в экстракте из шерсти животного. Оценить результат, сделать вывод.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм:
Постановка:
Постановка:
«К» «О»
Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Самостоятельная работа. Разобрать принцип постановки РП в геле. Сделать вывод.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм (см. выше)
Постановка:
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Выполните задания для самоконтроля:
Реакцию преципитации ставят в том случае, если____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Ингредиенты для постановки РП:
1.___________________________________________________________________________
2.___________________________________________________________________________
3.___________________________________________________________________________
Феномен реакции____________________________________________________________
Теоретическая справка
Работа № 1
Реакция агглютинации (РА)
Агглютинация - это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита (изотонического раствора хлорида натрия). Группы склеенных бактерий (клеток) называют агглютинатом. Для реакции агглютинации необходимы следующие компоненты:
1. Антитела (агглютинины), которые находятся в сыворотке больного или иммунного животного.
2. Антиген- взвесь живых или убитых микробов, эритроцитов или других клеток.
3. Изотонический (0,9%) раствор хлорида натрия.
Реакцию агглютинации для серодиагностики применяют при брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля), при бруцеллезе (реакция Райта и Хеддлсона), туляремии и т.д. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка. Эту реакцию широко применяют для диагностики кишечных инфекций, коклюша и др.
Методы постановки РА
Ориентировочная РА на стекле
Развернутая РА
(объемный метод)
Реакция коагглютинации
Развернутая РА на стекле (сероидентификация)
Реакция агглютинации на стекле. На обезжиренное предметное стекло наносят две капли специфической (адсорбированной) сыворотки и каплю изотонического раствора хлорида натрия. Неадсорбированные сыворотки предварительно разводят в соотношении 1:5 - 1:100. Капли на стекло необходимо наносить так, чтобы между ними было расстояние. Культуру петлёй или пипеткой тщательно растирают на стекле, а потом вносят в каплю изотонического, раствора хлорида натрия и в одну из капель сыворотки, размешивая в каждой до образования гомогенной взвеси. Капля сыворотки, в которую не внесена культура, является контролем сыворотки.
Внимание! Нельзя переносить культуру из сыворотки в каплю изотонического раствора хлорида натрия, которая является контролем антигена. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 мин. Если контроль сыворотки остаётся прозрачным, в контроле антигена наблюдается равномерная муть, а в капле, где культура смешана с сывороткой, появляются хлопья агглютината на фоне прозрачной жидкости, результат реакции считается положительным.
| «О» «К» |
Диагностическая Физиологический
сыворотка +культура раствор + культура
Развёрнутая реакция агглютинации (объемный метод). Готовят последовательные, чаще всего двукратные, разведения сыворотки. Метод называют объёмным. Для определения титра антител в сыворотке крови возьмите 6 пробирок. В первую пробирку налейте 1 мл исходного разведения сыворотки 1:50 и во все 6 пробирок градуированной пипеткой внесите по 1 мл физиологического раствора. В первой пробирке получится разведение сыворотки 1:100 при объёме 2 мл. Из первой пробирки 1 мл перенесите во вторую пробирку, где разведение станет 1:200. Так сделайте ряд последовательных разведений сыворотки в 5 первых пробирках (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Из пятой пробирки 1 мл вылейте в дезинфицирующий раствор. Во все 6 пробирок добавьте по 2 капли диагностикума. Шестая пробирка является контролем культуры, так как содержит только физиологический раствор и диагностикум.
| Ингредиенты | номер пробирки | ||||||
| контроль сыворотки | контроль диагности-кума | ||||||
| Физиологический | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| раствор | |||||||
| Сыворотка больного в | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | - |
| разведении 1:50 | |||||||
| Диагностикум (капли) | - | ||||||
| Разведение сыворотки | 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | 1:1600 | 1:100 | - |
Такой контроль необходим для исключения спонтанной агглютинации культуры. Пробирки встряхивают и помещают в термостат при температуре 37°С на 2 часа, а затем оставляют на сутки при комнатной температуре, после чего производят учёт результатов реакции агглютинации. При постановке реакции агглютинации с сыворотками детей первых месяцев жизни в связи с функциональной неполноценностью антителообразования необходимо выявление более низких титров антител, что учитывается при разведении сыворотки. Исходное разведение сыворотки берут 1:25. В первой пробирке получают разведение 1:50, затем 1:100 и т.д.
При положительном результате реакции в пробирках видны склеевшиеся клетки в виде зерен или хлопьев на фоне прозрачной жидкости.Агглютинат постепенно оседает на дно в виде «зонтика», а жидкость над осадком просветляется. Контроль антигена равномерно мутный.
По характеру осадка различают мелко- и крупнозернистую (хлопьевидную) агглютинацию. Мелкозернистая агглютинация получается при работе с О-сыворотками. Крупнозернистая - при взаимодействии подвижных микробов со жгутиковыми Н-сыворотками. Она наступает быстрее мелкозернистой, образующийся при этом осадок очень рыхлый и легко разбивается.
Интенсивность реакции выражается следующим образом:
++++ все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный;
+++ осадок меньше, нет полного просветления жидкости. Результат реакции положительный;
++ осадок еще меньше, жидкость мутнее. Результат реакции сомнительный;
на дне пробирки незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный результат реакции;
- осадка нет, жидкость равномерно мутная, как в контроле антигена. Отрицательный результат реакции
Работа № 2
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РПГА, РНГА)
Методы постановки РНГА
| РНГА с эритроцитарным антигенным диагностикумом |
| Реакция латекс-агглютинации |
| РНГА с унитиолом (выявление IgM и IgG) |
| Реакция Кумбса |
| РНГА с эритроцитарнымантительнымдиагностикумом |
В этой реакции микробный или растворимый антиген адсорбируется на поверхности эритроцитов, которые в таком «нагруженном» состоянии приобретают способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для микробного антигена. Учитывается реакция по образованию агглютинированными эритроцитами осадка в виде зонтика на дне планшетов, в то время как в контроле, без иммунной сыворотки, они оседают в центре, образуя пуговку с ровными краями. Реакция гемагглютинации является более чувствительной, чем агглютинация бактерий, применяется для диагностики при многих инфекционных заболеваниях, особенно у детей, при необходимости выявления антител в более низких титрах. Эта реакция может быть использована и для обнаружения антигенов при применении специфических сывороток
Методика
В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки. На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное «кольцо» - преципитат. Реакция сопровождается рядом контролей.
Реакция преципитации в геле
Иммунодиффузия в агаровом геле растворов антигенов и антител, залитых в разные лунки, навстречу друг другу в случаях соответствия их специфичности приводит к образованию специфического преципитата в виде полосок и дуг в местах встречи реагентов.
Как правило, в центральную лунку заливают стандартный раствор антигена, а в периферические - испытуемые сыворотки. В одну из периферических лунок заливается стандартная иммунная сыворотка соответствующей специфичности, а в другую -нормальная сыворотка для контроля. Проводится инкубация во влажной камере при 37°С в течение 24 ч. Учитывают количество и ширину полос преципитации между центральной лункой с раствором антигена и лунками с исследуемыми сыворотками.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА
Ситуационные задачи:
Что изображено на схеме?
Описать суть метода.
Применение в медицине.
Что изображено на схеме?
Какой метод исследования?
Описать суть метода.
Применение в медицине.
3)Что изображено на схеме?
Какой метод исследования?
Описать суть метода.
Применение в медицине.
Что изображено на схеме?
Какой метод исследования?
Описать суть метода.
Применение в медицине.
Подпись преподавателя_________________________________________________________
ЗАНЯТИЕ 1.3.4
СИСТЕМА АНТИГЕН-АНТИТЕЛО В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
Цель:изучить механизмы взаимодействия АГ-АТ, принципы и методы постановки: РА, РПГА, РП.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ЗНАТЬ:
1. РА. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.
2. РПГА. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.
3. РП. Компоненты, механизм, способы постановки, применение.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН УМЕТЬ:
использовать реакции иммунитета в диагностике инфекционных болезней.
СТУДЕНТ ДОЛЖЕН ИМЕТЬ ПРЕДСТАВЛЕНИЕ:
о существовании различных модификаций серологических реакций, усиливающих их чувствительность (информативность).
Теоретические аспекты:
Серология - раздел иммунологии, изучающий взаимодействие Аг иАт в реакциях invitro.
Серологические методы - совокупность реакций invitro, основанных на Аг-Ат взаимодействии и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма Ат, а также Аг в исследуемом материале.
Сероиндикация- обнаружение возбудителя в исследуемом материале (определение рода возбудителя) с поливалентными сыворотками.
Сероидентификация - определение вида возбудителя или отдельных антигенов с монорецепторными сыворотками.
Серодиагностика - обнаружение антител или определение титра антител в сыворотке крови
Схема описания реакции:
Направление (цель)
Ингредиенты (компоненты)
3) механизм (схема)
Способ постановки реакции
Результат
Работа №1. Реакция агглютинации (РА)
Цель: Разобрать механизм, освоить различные методы постановки РА в зависимости от цели исследования, интерпретировать результаты реакций.
1.Самостоятельная работа.Поставить, учесть, оценить результат РА.Определить родовую принадлежность выделенной чистой культуры в ориентировочной РА на стекле с поливалентными сыворотками: сальмонеллезной ABCDE, шигеллезной, иерсиниозной (сероиндикация)(см. теоретическую справку)
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм:
Постановка:
Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
2. Самостоятельная работа.Определить вид исследуемой культуры в развернутой РА на стекле с моновалентными сыворотками (сероидентификация). Поставить, учесть, оценить результат РА.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм (схема см. выше)
Постановка:
Результат:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
1. Самостоятельная работа.Учесть результат РА с дизентерийнымдиагностикумом с целью выявления антител в парных сыворотках пациента (серодиагностика). Парные сыворотки - это сыворотки от одного и того же больного, взятые в начале болезни и через одну две недели с целью выявления нарастания титра антител. Сделать вывод.
Направление:
Ингредиенты:
1)
2)
3)
Механизм (см. выше)
Постановка:
1 неделя
1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 КС КД
2 неделя
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Выполните задания для самоконтроля:
Агглютинация-_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Ингредиенты для постановки РА:
1.___________________________________________________________________________
2.___________________________________________________________________________
3.___________________________________________________________________________
Феномен реакции _____________________________________________________________