Основные принципы выделения чистых культур внутриклеточных паразитов, культивируемых на живых объектах. Этапы выделения чистых культур. Методы индикации вирусов.

Для культивирования облигатных внутриклеточных паразитов (риккетсии, хламидии, вирусы) используют живые объекты – клеточные культуры, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных. Клеточные культуры подразделяют на неперевиваемые (клетки эпителиальной или соединительной ткани в питательной среде), полуперевиваемые (диплоидные клетки человека) и перевиваемые (в основном опухолевые клетки – постоянное существование in vitro).

Куриные эмбрионы используют в возрасте 8 – 12 дней, они устойчивы к различным воздействиям. При заражении лабораторных животных недостатком является необходимость последующего заражения клеточной культуры для получения чистой линии.

Методы индикации вирусов:

• гибель или заболевание живой системы

• цитопатическое действие

• реакция гемадсорбции («зонтик» - положительная, «пуговка» - отрицательная)

• обнаружение вирусных включений

• цветная проба

• метод бляшек во флаконе

21. Методы определения родовой и видовой идентификации прокариот. Диагностическое значение экзоферментов прокариот. Диагностическое значение бактериофагов.

Поскольку ферментативный спектр является таксономическим признаком,характерным для семейства, рода и –в некоторых случаях- для видов.Изучение ферментов патогенных бактерий позволяет дифференцировать между собой различные виды микроорганизмов и ставить диагноз заболевания(используют «среды Гисса» для биохимической идентификации бактерий).

Бактериофаги используют в лабораторной диагностике инфекций при внутривидовой идентификации бактерий, т.е. определение фаговара. Для этого принимают метод фаготитрования. Методику фаготипирования используют для выявления источника и путей распространения инфекций. По содержанию бактериофагов в объектах окружающей среды можно судить о присутствии в них соответсвующих патогенных бактерий

22. Действие физических факторов на микробов. Температурные критерии жизнедеятельности микробов. Механизмы устойчивости микробов к высушиванию, излучениям.

Из физических факторов наибольшее практическое значение имеют температура, высушивание, излучения. В зависимости от температурного режима жизнедеятельности микроорганизмы делятся на три группы:

• психрофилы (оптимум 6 – 20˚С)

• мезофилы (34 – 37˚С)

• термофилы (выше 37˚С, у некоторых – до 80˚С)

Низкие температуры большинство микроорганизмов, в том числе и вирусы, переносит хорошо. Вегетативные клетки бактерий находятся при этом в анабиотическом состоянии. Также хорошо сохраняются культуры микробов и различного рода биологически активные препараты (например, вакцины). Некоторые бактерии остаются жизнеспособными при –190˚C,а бактериальные споры при –250˚C. Высокая температура, как правило, губительно действует на вегетативные формы бактерий и вирусы в результате денатурации белков. В естественных условиях высушивание оказывает губительное действие на вегетативные клетки многих бактерий, что связано с обезвоживанием их цитоплазмы и повреждением ЦПМ и рибосом. Высушенные споры бактерий сохраняют способность к прорастанию в течение 10 лет, а споры плесневых грибов – до 20 лет. Лиофильная сушка (высушивание в условиях вакуума из замороженного состояния) применяется для хранения микробных культур и биологических препаратов в течение длительного срока без потери их биологических свойств. Прямые солнечные лучи обладают бактерицидным свойством, которое обусловлено активностью их коротковолновой части – УФ-лучей с длиной волны 254 – 300 нм. Механизм их действия связан с образованием тиминовых димеров в ДНК бактериальной клетки. Бактерии и вирусы также чувствительны к проникающей радиации. Однако они погибают только при облучении сравнительно большими дозами, порядка 44000 – 280000 Р. Эти свойства применяются для стерилизации.

Хим. Вещества могут оказывать различное действие на микроорганизмы:

-не оказывать никакого либо влияния

-стимулировать или подавлять рост

-вызывать гибель

антимикробные химические вещества используются в качестве антисептических и дезинфицирующих средств

23. Определение понятий "стерилизация" и "асептика". Основные методы стерилизации. Методы контроля эффективности стерилизации.

Асептика – система мероприятий, предупреждающих попадание (внесение) микроорганизмов из окружающей среды в ткани или полости человеческого организма при лечебных и диагностических манипуляциях, а также в материал для исследования, в питательные среды и культуры микроорганизмов при лабораторных исследованиях.

Стерилизация – обеспложивание, т.е. полное уничтожение вегетативных форм микроорганизмов и их спор в различных материалах.

Основные методы:

1.Физические

• воздействием высокой температуры

 прокаливание в пламени спиртовки или газовой горелки – стерилизуют бактериологические петли, препаровальные иглы, пинцеты;

 кипячением – не менее 30 мин; стерилизуют мелкий хирургический инструментарий, предметные и покровные стёкла

 сухим жаром в сушильно-стерилизационном шкафу (печи Пастера) – воздух нагревается до 165 – 180˚С в течении 45 мнут; стерилизуют стеклянную посуду

 автоклавирование – подогретым водяным паром под давлением в автоклаве – температура 100 – 133˚С, давление 0,5 – 2 атм, время 15 – 30 мин

 тиндализация – дробная стерилизация при 56–58 ˚С в течение 1 ч 5 – 6 дней подряд; для стерилизации легко разрушающихся при высокой t˚ веществ (сыворотка крови, витамины и др.)

 пастеризация – нагревание при t˚ 70 – 80˚С в течение 5 – 10 мин с последующим быстрым охлаждением; не уничтожает споры;

• воздействием ионизирующих излучений

пастеризуют напитки и продукты путём ультрафиолетового облучения – используется УФ-излучение с длиной волны 260 – 300 мкм; используют бактерицидные лампы разной мощности (БУВ-15, БУВ-30) для стерилизации воздуха в боксах, операционных, детских учреждениях

2.Механическая стерилизация (фильтрование) – через асбестовые и мембранные фильтры с разным диаметром пор; стерилизация жидких материалов, невыдерживающих нагревания (сыворотка крови, антибиотики, компоненты питательных сред для бактерий и культур клеток)

3.Химические – 70% этиловый спирт, 5% спиртовой раствор йода, 2% раствор хлорамина, 0,1% раствор перманганата калия, перекись водорода, окись этилена и др.