Санитарно-микробиологическое исследование питьевой воды централизованного водоснабжения
Санитарно-микробиологическое исследование питьевой воды централизованного водоснабжения
При проведении исследований определяют:
Общее число микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре
Содержание общих и термотолерантных колиформных бактерий (ОКБ и ТКБ)
Содержание спор сульфитредуцирующих клостридий
Содержание колифагов
Пробу (в объеме 500 см3 ) отбирают в стерильную емкость, снабженную пробкой и колпачком, после предварительной стерилизации крана обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 минут при полностью открытом кране. При отборе пробы напор воды уменьшают.
1.1.1. Определение общего числа микроорганизмов, образующих колонии на питательном агаре.
Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 оС в течение 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза.
Проведение анализа. Из каждой пробы делают высев не менее двух объемов по 1см3. Вносят по 1 см3 воды в две стерильные чашки Петри, затем в каждую чашку вливают 8-12 см3 расплавленного и остуженного до 45-49 оС питательного агара. Быстро смешивают содержимое чашек на горизонтальной поверхности. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют 24 часа при 37 оС.
Учет результатов. Подсчитывают все выросшие на чашках колонии, наблюдаемые при двукратном увеличении. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды. Если на двух чашках наблюдается рост расплывчатых колоний или выросло более 300 колоний, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность. В этих случаях в протоколе отмечают «число КОЕ / см3 — ориентировочно». Если подсчет на чашках невозможен, то в протоколе отмечают «сплошной рост».
Норматив: в 1 см3 питьевой воды должно быть не более 50 КОЕ.
1.1.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий.
1.1.2.1. Метод мембранной фильтрации (основной метод). Общие колиформные бактерии (ОКБ) представлены грамотрицательными, оксидаза-отрицательными, не образующими спор палочкиами, способными расти на дифференциальных лактозных средах, ферментирующие лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 37 оС в течение 24-48 часов.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих колиформных бактерий, обладают их признаками и, кроме того, они способны ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при 44 оС в течение 24 часов.
Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивание посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей идентификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам.
Проведение анализа. При исследовании питьевой воды изучают три пробы объемом по 100 мл. При получении стабильных отрицательных результатов допустима фильтрация 300 см3 воды через один фильтр.
При фильтрации воды неизвестного качества целесообразно увеличить количество фильтруемых объемов для получения изолированных колоний на фильтре (например, 10, 40, 100, 150 см3 воды).
Фильтры помещают на чашки со средой Эндо и затем ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы 24 часа при 37 оС. Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, расплывчатые, выдают отрицательный ответ, свидетельсвующий об отсутствии ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивают через 24 часа.
Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактоза-положительных колоний: темно-красных; красных с металлическим блеском или без него или других подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число колоний каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.
Каждую отобранную изолированную колонию исследуют на:
а) наличие оксидазной активности; б) отношение к окраске по Граму (микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена); 3) ферментацию лактозы до кислоты и газа.
.Постановка оксидазного теста. Полоску фильтровальной бумаги помещают в чистую чашку Петри и смачивают 2-3 каплями реактива для оксидазного теста (например, 1% водным раствором тетраметил-n-фенилендиамина гидрохлорида) или используют СИБ-оксидазу. Готовые бумажные системы смачивают дистиллированной водой. Часть изолированной колонии стеклянной палочкой или платиновой петлей наносят штрихом на подготовленную фильтровальную бумагу. Реакция считается положительной, если в течение 1 мин появляется фиолетово-коричневое или синее (СИБ-оксидаза) окрашивание штриха. При отрицательной реакции цвет в месте нанесения культуры не меняется. При положительном результате эту колонию их дальнейшего исследования исключают.
Определение отношения к окраске по Граму. Из оксидаза-отрицательной колонии делают мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена: в капле 3% водного раствора КОН на предметном стекле эмульгируют бактерийную массу, взятую с плотной среды. После нескольких секунд перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются – реакция отрицательная.
Определение ферментации лактозы. Оставшуюся часть оксидаза-отрицательной грамотрицательной колонии засевают параллельно в две пробирки с лактозной средой;
— для подтверждения наличия ОКБ посев инкубируют при 37 оС 48 часов (просматривают через 24 часа);
— для подтверждения наличия ТКБ посев осуществляют в среду, предварительно прогретую до 43-44 оС, и инкубируют при 44 оС 24 часа.
Учет результатов. При отсутствии ОКБ и ТКБ на всех фильтрах результат записывают «не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 см3» и «не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 см3». В случае идентификации всех выросших подозрительных колоний число КОЕ ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 см3 воды.
Вычисление проводят по формуле X = , где Х – число колоний в 100 см3 воды; V – профильтрованный объем воды через фильтры, на которых велся учет; a – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.
Окончательный результат выдают: количество КОЕ ОКБ в 100 см3 воды, из них количество КОЕ ТКБ в 100 см3.
1.1.2.2. Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий
титрационным методом.
Метод основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды на жидкую питательную среду с последующим пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и идентификацией колоний по культуральным и биохимическим тестам.
Проведение анализа. При исследовании питьевой воды качественным методом засевают 3 объема по 100 см3. При исследовании воды с количественным определением ОКБ и ТКБ при повторном анализе производят посев: 3 объемов по 100 см3, 3 объемов по 10 см3, 3 объемов по 1 см3. Посев 100 см3 и 10 см3производят соответственно в 10 и 1 см3 концентрированной лактозо-пептонной среды, посев 1 см3 пробы проводят в 10 см3 среды обычной концентрации. Посевы инкубируют 48 часов при 37 оС. Из емкостей, где отмечено наличие роста (помутнение) и образование газа или только помутнение, производят высев бактериологической петлей на сектора среды Эндо для получения изолированных колоний. Посевы на среде Эндо инкубируют 18-20 часов при 37 оС.
При образовании помутнения и газа в среде накопления и росте на среде Эндо колоний, типичных для лактоза-положительных бактерий: темно-красных или красных, с металлическим блеском или без него, выпуклых с красным центром и отпечатком на питательной среде, дают положительный ответ на присутствие общих колиформных бактерий в данном объеме пробы.
Факт наличия ОКБ необходимо подтвердить если: в среде накопления отмечено только помутнение; принадлежность к лактоза-положительным колониям вызывает сомнение.
В этих случаях: проверяют наличие окрашенных отпечатков на среде Эндо после снятия петлей подозрительной колонии; выполняют оксидазный тест; подтверждают принадлежность к Граму; подтверждают способность к газообразованию при посеве изолированных 1-2 колоний каждого типа с каждого сектора на среду с лактозой с последующей инкубацией посевов при 37 оС в течение 24-48 часов.
Для определения ТКБ делают посев 2-3 изолированных колоний каждого типа с каждого сектора среды Эндо в пробирки с лактозной средой, нагретой до 44 оС и инкубируют в термостате 24 часа при 44 оС. Допускается просмотр посевов через 4-6 часов.
При образовании газа в среде накопления, росте на среде Эндо лактоза-положительных бактерий и выявлении их способности ферментировать лактозу до кислоты и газа в течение 24 часов при 44 оС дают положительный ответ на наличие в этом объеме пробы воды ТКБ. Во всех остальных случаях дают отрицательный ответ.
Учет результатов. При исследовании 3 объемов по 100 см3 результаты оценивают качественно и при обнаружении ОКБ и ТКБ хотя бы в одном из них, делается запись в протоколе «обнаружены в 100 см3». При исследовании полуколичественным методом определяют наиболее вероятное число (НВЧ) ОКБ и ТКБ по таблице «Расчет НВЧ бактерий в 100 см3 питьевой воды» в методических указаниях 4.2.1018-01. Результат сообщают без доверительного интервала. При отрицательном ответе – «не обнаружены в 100 см3».
Норматив: ОКБ и ТКБ должны отсутствовать в 100 см3 воды.
1.1.3.Определение спор сульфитредуцирующих клостридий
Сульфитредуцирующие клостридии — спорообразующие анаэробные палочковидные микроорганизмы, восстанавливающие сульфит натрия на железосульфитном агаре при 44 оС в течение 16-18 часов.
Метод основан на выращивании посевов в железосульфитном агаре в условиях, приближенных к анаэробным и подсчете черных колоний.
Проведение анализа. Пробу воды 20 см3 прогревают на водяной бане в пробирках 15 минут при 75 оС для уничтожения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды прогревание пробы можно не проводить.
Из каждой пробы питьевой воды делают посев или фильтруют 20 см3. При необходимости подбирают объемы с таким расчетом, чтобы в посевах (в фильтрах) выросло не более 10-15 колоний.
Определение методом фильтрования в пробирках. Перед посевом железосульфитный агар в пробирках расплавляют на водяной бане при 70-80 оС. После фильтрования установленного объема воды мембранный фильтр стерильным пинцетом берут за два противоположных края и согнув в виде «трубочки» помещают в пробирку с горячим агаром. Пробирку с агаром быстро охлаждают в холодной воде. Посевы культивируют 16-18 часов при 44 оС.
Определение методом фильтрования в чашках Петри. Чашки Петри заливают тонким слоем железо-сульфитного агара. После фильтрации фильтр помещают на застывшую питательную среду фильтрующей поверхностью вниз. Затем заливают расплавленным железо-сульфитным агаром до верхнего края чашки, чтобы крышка плотно прилегала к среде для создания анаэробных условий. Посевы культивируют 16-18 часов при 44 оС.
Определение прямым посевом. В стерильные пробирки вносят по 5 или 10 см3 исследуемой пробы воды, заливают горячим железо-сульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Пробирку быстро охлаждают. Посевы инкубируют при 44 оС в течение 16-18 часов.
Учет результатов. Количественному учету подлежат только посевы, в которых получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтрах, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают в колониеобразующих единицах спор сульфитредуцирующих клостридий в 20 см3 воды. При отсутствии роста черных колоний на всех фильтрах дают ответ «не обнаружены в 20 см3 воды». При невозможности учета колоний из-за сливного роста результат оценивается как качественный, в протоколе отмечают «обнаружено в 20 см3».
Норматив: споры сульфитредуцирующих клостридий должны отсутствовать в 20 см3 питьевой воды.
1.1.4. Определение колифагов.
Колифаги — бактериальные вирусы (бактериофаги), заражающие Escherichia coli и, в результате, формирующие зоны лизиса (бляшки) бактериальной культуры, засеянной «газоном» на питательном агаре через 18 часов инкубирования при 37 оС.
Титрационный метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает предварительное накопление колифагов в среде обогащения на культуре E.coli и последующее выявление зон лизиса (просветления) газона E.coli на питательном агаре. Метод предназначен для проведения текущего контроля качества питьевой воды.
Проведение качественного анализа. В исследуемую пробу воды объемом 100 см3 вносят питательный бульон и подготовленный смыв тест культуры E.coli, помещают в термостат и инкубируют 18 часов при 37 оС. Затем из исследуемой пробы воды отливают в пробирку 10 см3, добавляют хлороформ, пробирку закрывают стерильной резиновой пробкой, встряхивают и оставляют при комнатной температуре до полного осаждения хлороформа. В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют приготовленный смыв культуры E.coli. В стерильную чашку Петри пипеткой из пробирки переносят 1 см3 обработанной хлороформом пробы, заливают смесью расплавленного и остуженного до 45-49 оС питательного агара и осторожно покачивают для равномерного перемешивания пробы воды и агара. После застывания чашку переворачивают и инкубируют в термостате 18 часов при 37 оС. Параллельно проводят контроль культуры E.coli.
Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Проба считается положительной при наличии полного лизиса, просветлении нескольких бляшек, одной бляшки на чашке с пробой воды при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. В протоколе анализа отмечается: колифаги обнаружены или не обнаружены в 100 см3 воды. При наличии зон лизиса в контроле культуре результат считается недействительным.
Проведение количественного анализа. Исследуемую пробу воды в количестве 100 см3 разделяют на шесть порций: 1 флакон с 50 см3 и 5 пробирок с 10 см3. К 50 см3 пробы добавляют 5 см3 десятикратного питательного бульона и 0,5 см3 смыва E.coli. В каждые 10 см3 пробы вносят по 1 см3 десятикратного питательного бульона и по 0,1 см3 смыва бактерий.
Для контроля культуры 0,1 см3 смыва E.coli помещают в чашку Петри и заливают питательным агаром. Посевы инкубируют 18 часов при 37 оС.
Затем из объема 50 см3 отливают в пробирку 10 мл. Во все исследуемые 6 объемов добавляют по 1 см3 хлороформа. Пробирки закрывают резиновыми пробками, энергично встряхивают и оставляют при комнатной температуре для осаждения хлороформа.
В предварительно расплавленный и остуженный до 45-49 оС питательный агар добавляют смыв E.coli. Приготовленную смесь разливают в две чашки Петри: одну чашку для контроля культуры E.coli на лизогенность и одну чашку для исследуемой пробы воды. После застывания агара чашки, предназначенные для посева проб, разделяют на 6 секторов и маркируют в соответствии с исследуемыми объемами. На каждый сектор из соответствующей пробирки наносят пастеровской пипеткой (или бактериологической петлей продольным штрихом) по 1 капле надосадочной жидкости. После подсыхания капель чашки с исследуемыми пробами и контрольную чашку помещают в термостат при 37 оС на 18 часов.
Учет результатов. Просмотр результатов осуществляют в проходящем свете. Учитывают наличие зон просветления (лизиса) на секторах газона E.coli. При применении капельного способа посева пипеткой образуется зона лизиса в виде округлого пятна или отдельных бляшек. При посеве продольным штрихом бактериологической петлей отмечается лизис по ходу штриха. Пробу считают положительной при наличии зоны лизиса хотя бы на одном секторе при отсутствии зон лизиса на контрольной чашке. Оценку проводят по таблице наиболее вероятного числа (НВЧ) бляшкообразующих единиц (БОЕ). В протоколе анализов указывают наиболее вероятное количество колифагов в 100 мл воды в диапазоне возможных колебаний: НВЧ БОЕ (нижний предел – верхний предел) колифагов в 100 см3. Результат полуколичественный. При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат считают недействительным.
Прямой метод определения колифагов. Определение колифагов в питьевой воде включает исследование нормируемого объема воды (100 см3) путем его прямого посева и последующего подсчета зон лизиса (бляшек) на газоне E.coli в чашках Петри с питательным агаром. Прямой метод выделения колифагов из воды проводят параллельно с титрационным методом при исследовании по эпидемическим показаниям.
Проведение анализа. В питательный агар, расплавленный и остуженный до 45-49 оС добавляют смыв E.coli и перемешивают. Исследуемые 100 см3 воды разливают по 20 см3 в большие пробирки, нагревают до 35-44 оС и немедленно разливают в 5 чашек Петри. Затем в каждую чашку сразу же вносят по 20 см3 смеси агара с культурой E.coli. Для контроля культуры E.coli в одну чашку Петри вносят 20 см3 стерильной водопроводной воды, предварительно прогретой до 35-44 оС, заливают 20 см3 приготовленного агара с E.coli. Содержимое чашек осторожно перемешивают. Чашки с застывшим агаром помещают вверх дном в термостат и инкубируют в течение 18 часов при 37 оС.
Учет результатов. Просмотр посевов проводят в проходящем свете. Учет результатов осуществляют подсчета и суммирования числа бляшек, выросших на 5 чашках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. В контрольной чашке бляшки должны отсутствовать.
Наиболее часто зоны лизиса выглядят прозрачными пятнами на фоне газона тест-культуры питательного агара в виде круглых изолированных бляшек (от 1 до 5-7 мм в диаметре) с четко выраженными либо стертыми границами.
При высоких концентрациях фага можно наблюдать «ажурный» газон Е. coli, рост единичных колоний Е. coli на фоне сплошного лизиса, либо полное отсутствие роста на чашке.
Окончательный количественный учет прямого посева проводят через 18 часов. Результаты выражают количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 100 см3 пробы воды. Если отмечен сливной рост бляшек и подсчет затруднителен, то по данным прямого посева может быть выдан качественный результат: «обнаружено в 100 см3воды». При наличии зон лизиса в контрольной чашке результат исследования считается недействительным.
Норматив: В 100 см3 исследуемой воды должны отсутствовать БОЕ колифагов.
Содержание золотистого стафилококка (S.aureus) в 1 м3 воздуха
При исследовании воздуха по эпидемиологическим показаниям определяют также и патогенные микроорганизмы.Для количественного микробиологического исследования воздуха применяют аспирационный и седиментационный (в исключительных случаях) методы.
2.1.1. Определение общего содержания микроорганизмов в 1 м3
Аспирационный метод. Забор воздуха осуществляют аспирационным методом с помощью приборов (ПУ-1Б, «Флора», аппарат Кротова). Приборы устроены таким образом, что воздух с заданной скоростью засасывается через отверстия в крышке, закрывающей чашку Петри с питательным агаром. При этом частицы аэрозоля с содержащимися в них микроорганизмами равномерно фиксируются на своей поверхности среды благодаря постоянному вращению чашки под входным отверстием. Для определения общего количества микроорганизмов засевают по 100 дм3 воздуха на 2 чашки Петри с 2% питательным агаром. После инкубации посевов при 37 оС в течение 48 часов проводят подсчет колоний, выросших на чашках. Производят перерасчет на 1м3 воздуха. Показатель выражают в КОЕ/м3.
Седиментационный метод (обычно применяют для исследования воздуха в боксах во время работы). Для контроля стерильности воздуха в боксах 2 чашки Петри с 2% мясо-пептонным агаром оставляют открытыми в течение 15 минут, после чего посевы инкубируют при 37 ºС 48 часов. Результаты оценивают по суммарному числу колоний, выросших на обеих чашках.
Норматив: допустимо присутствие не более 3 КОЕ неспорообразующих сапрофитов на чашках.
2.1.2. Определение содержания S.aureus в 1 м3. При проведении исследований 250 дм3 воздуха засевают на чашки с желточно-солевым агаром (ЖСА) или молочно-желточно-солевым агаром (МЖСА). Посевы инкубируют при 37 ºС 48 часов. Отбирают подозрительные колонии (круглые, блестящие, выпуклые, пигментированные, с положительной и отрицательной лецитовителлазной реакцией). Подозрительные колонии (не менее 2-х) микроскопируют и пересевают в пробирки со скошенным питательным агаром. Инкубируют посевы при 37 ºС в течение 24 часов. Идентификацию проводят по морфологическим, тинкториальным свойствам и плазмокоагулирующей активности. Стафилококки окрашиваются по Граму положительно (фиолетово-синие кокки, располагающиеся гроздьями). Плазмокоагулирующую активность выявляют в реакции коагуляции плазмы (РКП). При выявлении только плазмокоагулирующей или только лецитовителлазной активности выделенной культуры, определяют ферментацию маннита и мальтозы в анаэробных условиях, гемолитическую активность, хлопьеобразование, образование ацетоина. При необходимости проводят фаготипирование выделенных культур, определяют чувствительность бактерий к антибиотикам, бактериофагам и дезинфектантам. Результаты выражают в КОЕ/м3.
Нормативы: в воздухе помещений класса чистоты А и Б общее количество микроорганизмов должно находится в допустимых пределах, золотистого стафилококка не должно быть. Санитарное состояние воздуха помещений классов чистоты В и Г не нормируется.
Таблица 1. Допустимые уровни бактериальной обсемененности воздушной среды в больничных помещениях
| Место отбора проб: | Класс чистотыпомеще-ний | Общее количество микроорганизмов в 1м3 воздуха (КОЕ/ м3) | Наличие S.aureus в 1м3 воздуха | |
| До начала работы | Во время работы | |||
| Операционные, послеопера-ионные и реанимационные залы, в том числе для ожоговых больных, палаты интенсивной терапии, родовые залы, манипуляцион-но-туалетные для новорож-денных | А | Не более 200 | Не более 500 | Не должно быть |
| Послеродовые палаты, палаты для ожоговых больных, палаты для лечения пациентов в асептических условиях, в том числе для недоношенных с нарушениями иммунного статуса | Б | Не более 500 | Не более 750 | Не должно быть |
| Послеродовые палаты с совместным пребыванием ребенка, палаты для недоношенных, грудных, травмированных новорожденных | Б | Не более 500 | Не более 750 | Не должно быть |
| Палаты для взрослых больных, помещения для матерей детских отделений | В | Не нормируется | Не нормируется | Не нормируется |
| Диспетчерские, комнаты персонала, комнаты отдыха пациентов после процедур | Г | Не нормируется | Не нормируется | Не нормируется |
Титрационный метод
Из разведения 1:10 почвенной суспензии 10 см3 засевают на 90 см3 среды Кесслера, остальные разведения сеют по 1 см3 в 9 см3 среды. Посевы выращивают при температуре 37 оС 48 часов. При отсутствии роста (помутнение, газообразование) дают отрицательный ответ. При наличии помутнения и газообразования или при наличии только помутнения делают высев на среду Эндо. Чашки с посевами инкубируют при 37 оС 18-24 час. Отбирают розовые, красные или малиновые с металлическим блеском колонии, изучают морфологические, тинкториальные свойства, ставят оксидазный тест. По 2-3 колонии каждого типа (грамотрицательные, оксидазаотрицательные) засевают параллельно в 2 в пробирки с полужидкой или жидкой с поплавком средой с лактозой, инкубируют в термостате 37 оС 18-24 час. При ферментации лактозы с образованием кислоты и газа дают положительный ответ на БГКП.
Результаты выражают в величинах коли-индекса.
Норматив. Индекс БГКП 1-10 клеток/г почвы
Метод мембраной фильтрации. Используют в качестве ускоренного метода. Применяют фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и размером диска 35 или 47 мм. Фильтруют 5,0-10,0 см3 почвенной суспензии первого разведения (1:10) через мембранные фильтры, сеют на дифференциальную питательную среду с лактозой, отбирают подозрительные колонии, идентифицируют бактерии по культуральным и биохимическим свойствам.
Метод прямых поверхностных посевов. Применяют при анализе загрязненных и сильно загрязненных почв.
На среду Эндо засевают по 0,1 или 0,2 см3 разведений почвы: от 10-1 до 10-3 для сравнительно чистых почв, из разведений до 10-5 и 10-6 для сильно загрязненных почв. Среды обычно используют подсушенные. Растирают посев шпателем. Инкубация посевов 37 оС 24 часа. Дальнейшая идентификация аналогична рассмотренной выше ( в титрационном методе, начиная со среды Эндо). Посчитывают количество колиформных бактерий в 1 г почвы, для чего среднее число колиформных колоний, выросших на чашках, умножается на степень десятикратного разведения. Результаты выражают в количестве КОЕ/г.
Норматив. До 10 КОЕ/г
Определение энтерококков.
Энтерококки — грамположительные, не образующие каталазу кокки, слегка вытянутые с заостренными концами. В мазках располагаются парами или короткими цепочками, реже одиночно. При росте на жидких средах (лактозо-пептонная среда, ЛПС; щелочная элективная среда с полимиксином, ЩЭС) вызывают диффузное помутнение и образование осадка.
Для выявления энтерококков используют титрационный метод и метод мембранной фильтрации.
Титрационный методприменяют для анализа почв с предполагаемой невысокой степенью загрязнения.
Из разведений почвенной суспензии стерильной пипеткой берут 10 см3 и засевают во флаконы с 50 см3 жидкой среды (ЛПС или ЩЭС). Посевы инкубируют 24 час при 37 оС. При наличии признаков роста производят высев на плотные среды МИС (молочно-ингибиторная среда) или ЖСТ (желточная среда Турчинского). Инкубируют 24-48 часов. В случае отсутствия роста дают отрицательный ответ.
При наличии аспидно-черных, выпуклых с металлическим блеском или сероватых, мелких колоний проводят микроскопию окрашенных по Граму мазков и каталазный тест.
После выявления энтерококков устанавливают титр, при котором принимается то предельное разведение почвы, в котором обнаруживают энтерококки. Для перевода титра в индекс, необходимо 1000 разделить на число, выражающее титр.
Содержание мезофильных аэробных и факультативно – анаэробных микроорганизмов (КМАФАМ). Количество МАФАМ выражают в КОЕ в одном см3 или одном г продуктов
Наличие БГКП
Наличие сальмонелл
Наличие стафилококков
Наличие листерий
Ставят пробу на брожение
4.2.1 Определение содержания МАФАМ.
При исследовании пастеризованное молоко разводят стерильным физиологическим раствором в соотношениях 1:10; 1:100, 1:1000 и вносят по 1,0 см3 в чашку Петри и заливают расплавленным и остуженным МПА, перемешивают и инкубируют трое суток при 30 оС, затем подсчитывают число выросших колоний по формуле:
X = n10m
где Х - количество МАФАМ в 1 см3
n - количество колоний
m – степень разведения
Норматив. Количество МАФАМ для пастеризованного молока в потребительской таре должно быть не должно превышать 105 КОЕ/см3.
4.2.2. Определение БГКП.
Пастеризованное молоко разводят физиологическим раствором в соотношении 1:10; 1:100 и засевают по 1 см3 в 3 пробирки со средой Кесслера с поплавками: В 1 пробирку вносят 1 см3 цельного молока; во 2 пробирку — 1 см3 из разведения 1:10 и в 3-ю — 1 см3 из разведения1:100. Термостатируют 18-24 часа при 37 оС. При отсутствии газообразования в наименьшем из засеваемых объемов дают заключение об отсутствии в нем БГКП. При наличии газообразовании отмечают, что БГКП в нем обнаружены.
Норматив. БГКП не должны обнаруживаться в 0,01 см3 пастеризованного молока.
4.2.3. Выявление сальмонелл.
По ГОСТу определения сальмонелл не проводят, но согласно СанПиН в 25 граммах продукта сальмонеллы должны отсутствовать. Поэтому выявление бактерий рода сальмонелл, необходимо проводить по ГОСТ Р 52814 – 2007. Пробы засевают на забуференную пептонную воду в соотношении 1:9. Инкубируют 24 часа при 37оС. Затем делают высев по 1 см3 в 2 среды обогащения: RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) и тетратионатный бульон либо селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана). Среду RVS (Раппопорта-Вессилиадиса с соей) инкубируют 41 оС-24 часа, а селенитовый бульон или Мюллера-Кауфмана 24 часа 37 оС. Через 24 часа делают пересев на среды: XLD (ксилоза-лизин декстрозный агар) и Эндо, Левина или Плоскирева. Термостатируют 24 часа при 37 оС и учитывают характер роста (сальмонеллы образуют на среде Эндо колонии S-формы бесцветные или розовые) и делают отсев на скошенный МПА. Пробирки инкубируют 24 часа 37 оС.
Через 24 часа ставят реакцию агглютинации (РА) на стекле с поливалентными сальмонеллезными сыворотками А, В, С, D и Е. В случае положительной реакции ставят РА с групповыми сыворотками. Одновременно с РА материал засевают на среду Олькеницкого и изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород. После инкубации (24 часа 37 оС) отмечают характер роста микроорганизмов. Сальмонеллы подвижными, не расщепляют лактозу и сахарозу, расщепляют глюкозу, образуют H2S и не образуют индол. У выделенной чистой культуры бактерий изучают другие биохимические свойства путем посева на среды Гисса и МПБ с индикаторными бумажками на индол и сероводород.
Для определения серовара сальмонелл используют РА с моновалентными О- и Н- сальмонеллезными сыворотками.Обнаружение микроорганизмов, образующих характерные колонии на средах XLD и Эндо, имеющих характерные морфологические, биохимические и антигенные свойства, указывает на присутствие в исследуемом пищевом продукте сальмонелл.
Норматив. Сальмонеллы должны отсутствовать в 25 см3 молока.
4.2.4. Выявление Staphylococcus aureus.
Проводят в соответствии с ГОСТом 303447 – 97 «Молоко и молочные продукты».
Определение S. аureus в определенном объеме продукта с предварительным обогащением. Из ранее приготовленных разведений, используем ту массу, в которой по нормативному документу S. aureus должен отсутствовать. Например: в молоке пастеризованном в потребительской таре наличие S. aureus не допускается в 1,0 см3.
Для выявления S. aureus 1 см3 цельного продукта вносят в пробирки с солевым бульоном (1:10), инкубируют при 24 часа 37 оС. Через 24 часа отсевают на среду Бэйрд – Паркера (ЖСА, МСА). Инкубируют 24-48 часов при 37ооС, готовят мазки и отсевают характерные колонии на МПА. Посевы инкубируют 24 часа при 37 оС, а затем ставят пробу на плазмокоагулазу.
Наличие характерных морфологических, культурных свойств и положительной реакции плазмокоагуляции свидетельствует о присутствии коагулазоположительных стафилококков в определенном объеме.
Норматив: золотистых стафилококков не должно быть в 1см3 пастеризованного молока в потребительской таре.
4.2.5. Определение листерий.
Исследование включает несколько этапов:
1-й этап. Для определения листерий подготовленную навеску продукта (25 г/см3) вносят в среду для первичного обогащения в количестве 225 мл (ПБЛ 1 — питательный бульон для листерий) и инкубируют 24 часа при 37 оС.
2-й этап. Затем 0,1 см3суспензии из молока пересевают в 10 см3 среду вторичного обогащения (ПБЛ 2) и инкубируют 48 часов при 37 оС.
3-й этап. Через 48 часов из пробирок независимо от наличия или отсутствия признаков роста отсевают 0,1 см3 на поверхность двух чашек с ПАЛ (РАLСАМ) агаром инкубируют 24-28 часов при 37 С.
Примечание: допустимо не проводить второй этап (этап вторичного обсеменения) при посеве с низким исходным уровнем микробной контаминации и при отсутствии признаков роста в жидкой среде первого этапа, т.е. переходить сразу к посеву на агаризованные среды.
4-й этап. Изучают характер роста: на среде PALCAM — через 24 часа листерии формируют мелкие, серовато-зеленые или оливково-зеленые колонии с черным ореолом, диаметром 0,5-1,0 мм., иногда с черным центром. Через 48 часов их диаметр равен 1,0-2,0 мм.; колонии становятся зелеными с углубленными центрами, окруженными черным ореолом. Кокковая флора образует желтые колонии за счет ферментации маннита. Отобранные колонии (3-5) пересевают на МПА, дополненный 1% глюкозы. Посевы инкубируют посевы 24 часа при температуре 30 о С.
5-й этап. Включает:
а) микроскопию (грамположительные тонкие короткие палочки, спор не образуют).
б) определение каталазной активности (положительны)
в) определение подвижности посевом уколом на полужидкий агар PALCAM в 2 пробирки. Одну инкубируют при 25 оС, другую при 37 о С 48-72 часов. При 20-25 оС подвижны, характер роста напоминает зонтик; неподвижны при 35-37 оС.
г) определение способности восстанавливать нитраты.
д) определение ферментации углеводов. Проводят посев на пестрый ряд (не утилизируют маннит, ксилозу; утилизируют рамнозу с образование кислоты) при 37 о С в течении 7 дней.
е) Определение гемолитической активности на кровяном агаре (образует зону гемолиза вокруг колоний)
Норматив. Наличие листерии не допускаются в 25 г или см3 продукта.
4.2.6. Определение редуктазной активности.
Проводят при исследовании сырого молока. Метод основан на способности восстанавливать метиленовый голубой ферментами, выделяемыми микроорганизмами, присутствующими в молоке. По продолжительности изменения окраски оценивают бактериальную обсемененность сырого молока. Чем медленнее процесс, тем меньше микроорганизмов в молоке, тем лучше его качество.
4.2.7. Проба на брожение.
Применяют при определении пригодности молока для производства сыра. Метод основан на способности некоторых микроорганизмов, присутствующих в молоке, свертывать его. Чем медленнее происходит образование сгустка без выделения сыворотки и пузырьков газа, тем лучше качество молока.
Исследование мяса по СанПин
При санитарно-микробиологическом исследовании мяса определяют:
— наличие МАФАМ
— наличие БГКП
— наличие сальмонелл
— наличие листерий
4.4.2.1. Для определения МАФАМ делают разведения из расчета 1:10, 1:100 и 1:1000. Для этого 10 г продукта вносят в 90 см3 физиологического раствора (1:10). Из него готовят разведения 1:100 и 1:1000. Затем из каждого разведения по 1 см3 сеют в 2 стерильные чашки Петри и заливают расплавленным и остуженным МПА. Посевы инкубируют 72 часа при 30 оС. Затем делают подсчет выросших колоний, учитывая разведение.
Норматив: количество МАФАМ должно быть не более 10 КОЕ/г.
4.4.2.2. Для определения количества БГКП 10 см3 исходной взвеси (1 г продукта) сеют на среду Кесслера. Дальнейшие исследования проводят по методу, указанному выше (4.1.2).
Норматив: БГКП – не должны обнаруживаться в 1 г продукта.
4.4.2.3. Для определения сальмонелл делают посевы по обычной схеме (4.1.3).
Норматив – сальмонеллы не должны определяться в 25 г мяса.
4.4.2.4. Для определения листерий делают посевы по обычной схеме (4.2.5).
Норматив: листерии не должны определяться в 25 г мяса.
МАФАМ, .
БГКП,
Бактерии рода Salmonella
Бактерии рода Proteus.
4.4.3.1. Для выявления МАФАМ по 1,0 см3 из разведений 1:100, 1:1000 засевают на чашки глубинно, заливают расплавленным и остуженным до 50 оС МПА. Посевы инкубируют 72 часа при 30 оС, затем подсчитывают количество выросших колоний, выражая результат в КОЕ/г.
4.4.3.2. Для выявления БГКП 1,0 см3 исследуемой взвеси из разведения 10-4 высевают на среды Хейфеца или Кесслера, дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.2).
4.4.3.3. Для выявления бактерий рода Salmonella кусочки весом 25 г первоначально засевают на забуференную пептонную воду, дальнейшее исследование проводят как описано выше (4.1.3.).
4.4.3.4. Для выявления бактерий рода Proteus 0,5 см3 из разв