Клинические проявления течения и диагностика болезни

14. Инкубационный период при ККГЛ равен в среднем 2-7 дням, в редких случаях удлиняется до 12 дней. Различают следующие клинические периоды болезни: 1) начальный; 2) разгар; 3) реконвалесцентный.

15. Начальный период продолжается 1-3 дня. Начало болезни острое, с точным указанием больными не только дня, но и часа заболевания. Продромальный период отсутствует. Появляются сильная головная боль, резкая слабость, боли в мышцах и костях, суставах, реже в пояснице и животе, отмечаются нарушения сна, снижение аппетита, нередко тошнота и рвота, не связанные с приемом пищи. Температура тела быстро повышается, достигая 39-40 градусов Цельсия (далее-°С), и ощущается как чувство жара, чередующееся с ознобом. При осмотре у больных обнаруживается гиперемия кожи лица, шеи и верхнего отдела грудной клетки. Конъюнктива гиперемирована, склеры инъекцированы. Зев также гиперемирован. Периферические лимфоузлы не увеличены. Границы сердца в пределах нормы, тоны приглушены, ритм правильный, отмечается относительная брадикардия (частота сердечных сокращений отстает от температуры тела). Артериальное давление снижено. Физикальные данные со стороны легких изменены. Язык сухой, обложен, нередко утолщен, с отпечатками зубов. Живот мягкий, пальпация изредка болезненна в эпигастрии и по ходу кишечника. Может быть положительным симптом Пастернацкого. Диурез не нарушен, стул – склонность к запорам, иногда – понос. Уже в этом периоде встречается геморрагический синдром.

16. Геморрагический синдром начального периода характеризуется появлением сыпи, образованием гематом на местах инъекций, носовым кровотечением. В этом периоде реже встречаются другие виды кровотечения, такие как маточное, кишечное и почечное. В общем анализе крови отмечается сгущение – увеличение количества эритроцитов и гемоглобина, лейкопения со сдвигом влево в формуле нейтрофилов, тромбоцитопения, нормальная или умеренно ускоренная скорость оседания эритроцитов (далее – СОЭ). В моче альбуминурия, микрогематурия, иногда цилиндрурия.

17. Период разгара продолжается 4-7 дней и характеризуется усилением общей интоксикации, геморрагического синдрома. В этом периоде отмечается врез температуры (чаще на 3-5 дней), характерной для ККГЛ двугорбой (дромодерной) температурной кривой. Врез температуры часто появляется перед или в первый день появления геморрагического синдрома.

18. Продолжаются предъявление жалоб на головную боль, общую слабость, снижение аппетита, тошноту и рвоту. Уменьшаются боли в костях, мышцах, нарушение сна. Сохраняется характерный вид больных с гиперемией кожи лица, конъюнктивы с инъекцией склер.

19. Геморрагический синдром в период разгара является наиболее тяжелым, одним из наиболее постоянных проявлений болезни. Появляется он чаще на 2-5 день болезни и выражается в виде геморрагической сыпи на коже и слизистых, гематом на месте инъекций и в других местах, а также в виде кровотечений из различных органов. Сыпь чаще петехиальная, располагается на груди, по боковым поверхностям туловища, на плечах. При тяжелой форме сыпь крупная геморрагическая, неправильной формы, вплоть до геморрагической пурпуры.

20. Из полостных кровотечений чаще встречаются маточные и желудочно-кишечные кровотечения, которые угрожают жизни больного. Жалобы на «чувство жара» в желудке, часто предшествуют обильному желудочному кровотечению, которое клинически выражается рвотой «кофейной гущи» или кровью. Обильное почечное кровотечение при ККГЛ встречается редко.

21. Патологические изменения со стороны органов дыхания при ККГЛ встречаются редко, у немногих больных наблюдаются бронхиты, пневмонии. Изредка при этом заболевании обнаруживаются сухие плевриты.

22. Изменения со стороны сердечно-сосудистой системысводятся к брадикардии, приглушенности тонов сердца, гипотонии. У детей и беременных брадикардии может и не быть.

23. У 8,6 процентов (далее – %) больных над верхушкой сердца выслушивается систолический шум. При выраженных профузных кровотечениях брадикардия сменяется тахикардией. Пульс учащается до 120-140 ударов в минуту (далее – уд/мин), понижается его наполнение и напряжение. Появление тахикардии прогностически неблагоприятный признак.

24. Выраженная гипотония у больных удерживается длительно, захватывая период реконвалесценции. У тяжелых больных развивается коллаптоидное состояние, клиническая картина шока.

25. Электрокардиографические изменения характеризуются отклонением электрической оси сердца влево, диффузными изменениями в миокарде, снижением биоэлектрической активности в мышцах.

26. Изменения со стороны желудочно-кишечного тракта проявляются анорексией, тошнотой и рвотой, болями в животе. Наблюдаются также дисфункции кишечника и кровотечения из слизистых желудочно-кишечного тракта. У половины больных язык сухой, обложен, а у четверти – утолщен, с отпечатками зубов.

27. Печень в этом периоде увеличивается у ¹/₃ больных. Печень выступает из-под края реберной дуги на 2-3 сантиметра (далее – см), плотноэластической консистенции, поверхность гладкая, нижний край округлый. У некоторых больных наблюдается субэктеричность склер, связанная как с гемолизом эритроцитов, так и с поражением печени. Поражение печени у части больных характеризуется изменениями в биохимическом анализе крови: умеренная гипербилирубинемия, повышение аланинаминотрансферазы (далее-АЛТ). Отмечается снижение уровня общего белка и альбуминов в крови.

28. Изменения со стороны нервной системы характеризуются астено-вегетативным синдромом, нарушением сна. У тяжелых больных наблюдается раздражение мозговых оболочек, нарушения периферической иннервации, сознания. При менингоэнцефалитическом синдроме исследование ликвора воспалительных изменений не обнаруживает.

29. Изменения со стороны периферической крови, в период разгара с присоединением геморрагического синдрома, резко меняются. Наблюдаются анемия, резкая тромбоцитопения, изменения в коагулограмме зависит от стадии развития синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (далее – ДВС-синдром). Скорость оседания эритроцитов ускорена. Нейтрофилез сменяется нейтропенией и относительным лимфоцитозом.

30. Период реконвалесценции у больных ККГЛ проходит медленно. Так, у 16% больных продолжаются жалобы на слабость, головную боль после 10-го дня заболевания. Характерный внешний вид с гиперемией лица и шеи сохраняется у 8-10% больных. Периодически повышается температура тела до субфебрильных цифр, повторяется кратковременное необильное носовое кровотечение. Длительно сохраняется астеновегетативный синдром, лабильность пульса, склонность к гипотонии.

31. По степени тяжести различают легкую, среднетяжелую и тяжелую формы заболевания.

32. При легкой форме ККГЛ протекает с непродолжительной лихорадкой, слабостью, снижением аппетита, общим недомоганием, умеренной головной болью. Бывает носовое кровотечение. Сыпь на коже петехиальная, больших гематом в местах инъекций не наблюдается. Гиперемия кожи лица, шеи и верхнего отдела груди, умеренная инъекция склер и гиперемия ротоглотки имеются всегда. Изменения в крови – умеренная лейкопения с небольшим сдвигом влево, тенденция к ускорению СОЭ. Исход заболевания благоприятный, трудоспособность восстанавливается полностью в течение месяца после выписки из стационара.

33. При среднетяжелой форме лихорадочный период длится 4-7 недель. Налицо симптомы общей интоксикации (вялость, сильные головные боли, нарушение сна, тошнота, иногда рвота, диарея), геморрагический синдром выражен четко. Кровотечения часто из двух и более органов и обильны (до 500-600 миллилитров (далее-мл.)). Сыпь геморрагическая, более крупная, выражены гематомы. Изменения в крови – лейкопения с резким сдвигом влево, небольшая эритропения с анемией, ускорения СОЭ, тромбоцитопения, снижение протромбинового индекса. Нормализация картины крови через 4-5 недель от начала заболевания. Общее состояние больных улучшается через 2 недели, но трудоспособность наступает через 3 месяца от начала заболевания.

34. Тяжелая форма характеризуется бурным развитием общетоксических проявлений. На фоне гипертермии быстро нарастают симптомы общей интоксикации (к вышеописанным проявлениям присоединяются нарушения сознания, бред, возможны проявления менингеальных и очаговых симптомов). Кровотечения обильные до 1-2 литров (далее – л), из нескольких органов. Обширные гематомы, геморрагическая пурпура. Развивается ДВС-синдром с резкой тромбоцитопенией. Если общая летальность при ККГЛ не превышает 10%, то среди больных тяжелой формой она достигает 30% и более. Картина крови: эритроцитопения до 1-2^.10¹² грамм на литр (далее-г/л), гемоглобин 20-25 г/л и ниже, тромбоцитопения до 4 тысяч (далее – тыс.) Резкие изменения в коагулограмме со снижением протромбинового индекса, количества фибриногена Б. Выздоровление наступает медленно, а трудоспособность восстанавливается через 6-12 месяцев. Реконвалесценты тяжелой формы ККГЛ нуждаются в трудоустройстве.

35. Диагноз ККГЛ должен основываться на клинико-эпидемиологических данных. В анамнезе должны обращать внимание на укус клеща, попадание крови напитавшихся клещей на тело заболевшего, на контакт с больным ККГЛ, на контакт с кровью больного.

36. В эпидемический период (весна и раннее лето), в неблагополучной по ККГЛ местности, больные со схожей клиникой должны наблюдаться как больные ККГЛ. В этих случаях, после госпитализации их в инфекционный стационар с соблюдением особого режима при ККГЛ, надо проводить дифференциальную диагностику с другими заболеваниями.

37. Ранняя диагностика основывается на учете клиники предгеморрагического периода: характерный вид больных с гиперемией кожи лица, шеи, катаральным конъюнктивитом, склеритом; лихорадки с симптомами общей интоксикации, брадикардии, гипотонии; фульгинозного языка; иногда увеличение печени; характерных изменений периферической крови (лейкопения, тромбоцитопения и др.) и мочи (микроматурии с умеренной альбуминурией, иногда цилиндрурии. С присоединением геморрагического синдрома (экзантема, энантема, гематома, кровотечения) диагноз значительно облегчается. Необходимо помнить об атипичных формах ККГЛ без геморрагического синдрома.

38. Дифференциальная диагностика ККГЛпроводится как с инфекционными, так и с соматическими заболеваниями, протекающими с лихорадкой, симптомами общей интоксикации и геморрагическим синдромом. При дифференциальном диагнозе с инфекционной патологией протекающей с наличием геморрагического синдрома, такие как грипп, ОРВИ, вирусные гепатиты, лептоспироз, а также учетом весенне-летнего периода, с зоонозами, такими как бруцеллез, лихорадка Ку, иерсиниозы.

39. Критериями, позволяющими четко дифференцировать ККГЛ от других заболеваний, являются лабораторные методы диагностики.

Лабораторная диагностика

40. Лабораторная диагностика ККГЛ осуществляется путем выделения вируса от больного, определения вирусного антигена и специфических антител с помощью иммунологических реакций, а также методом полимеразной цепной реакции (далее-ПЦР).

41. Изоляция вируса ККГЛ из материала взятого от больного и дальнейшая идентификация проводится в лаборатории, отвечающей требованиям работы с возбудителями II- группы патогенности. Для выделения возбудителя используется кровь больных в остром периоде болезни, внутренние органы (печень, селезенка) и сгустки крови умерших, а также иксодовые клещи, собранные в очагах заболевания.

42. Выявление вирусного антигена в реакции непрямой гемагглютинации (далее-РНГА). Принцип РНГА заключается во взаимодействии антител (далее – АТ), адсорбированных на поверхности эритроцитов, с гомологичным антигеном (далее – АГ), содержащемся в исследуемом материале, в результате чего происходит агглютинация сенсибилизированных эритроцитов.

43. РНГА используется для индикации вируса ККГЛ в различных источниках: в крови больных людей, в трупных материалах людей и животных, а также в членистоногих переносчиках. Для обнаружения АГ вируса ККГЛ в РНГА сыворотку крови больных необходимо исследовать в остром периоде болезни.

44. В реакции используются следующие ингредиенты: иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум крымской геморрагической лихорадки, иммуноглобулиновый эритроцитарный диагностикум гетерологичный (клещевого энцефалита), исследуемый материал (сыворотка крови больного, кусочки органов, клещи) и физиологический раствор (далее – физ. р-р) со стабилизатором.

45. Обнаружение антигена вируса ККГЛ в исследуемом материале с помощью РНГА состоит из следующих этапов:

1) обработка исследуемого материала:

сыворотку крови больных разводят 1:5 физ. р-р (к 0,8 мл. физ.р-ра добавляют 0,2 мл сыворотки) и прогревают в течение 20 минут (далее – мин) при 56 °С. Затем добавляют 0,1 мл осадка отмытых эритроцитов барана (можно формалинизированных). Смесь встряхивают в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 1500 оборотов в минуту (далее – об/мин) (3-4 минуты). Надосадочную жидкость используют для постановки реакции.

Органы погибших людей, животных, отловленных в очагах инфекции (кусочки мозга, печени) тщательно растирают в ступке, добавляют физ.р-р в количестве необходимом для получения 10% суспензии (на 1 г ткани 1 мл физ. р-ра). Суспензию цинтрифугируют 10-15 мин. при 3-5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость исследуют в РНГА.

Клещей объединяют в пулы, содержащие 10 особей одного вида и пола, тщательно растирают в ступке, добавляя необходимое количество физ. р-ра (1,0 мл), готовят 1% суспензию. Суспензии центрифугируют в течение 10 минут при 2-3 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость используют в РНГА;

2) Приготовление растворов:

физ р-р готовят растворяя 8,5 г хлористого натрия в дистиллированной воде.

Стабилизирующий раствор готовится следующим образом: к 100 мл физ.р-ра добавляют 10 миллиграмм (далее – мг) сухого бычьего сывороточного альбумина. Раствор хранению не подлежит и готовится перед каждым опытом;

3) Разведение исследуемого материала:

из обработанного материала готовят двукратные разведения в серологических пробирках или досках для гемагглютинации. Так, например, для разведения сыворотки больного готовят ряд из 8 пробирок. В каждую пробирку начиная со второй добавляют по 0,5 мл стабилизирующего раствора. Затем в первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл обработанной сыворотки. В последующем из второй пробирки переносят 0,5 мл смеси в третью пробирку и так далее по 0,5 мл. Таким образом, получаются следующие разведения сыворотки: в первой пробирке – 1:5, во второй – 1:10, в третьей – 1:20, в четвертой – 1:40 и так далее;

4) Техника постановки РНГА:

реакцию ставят в панелях микротитратора Такачи в объеме 0,075 мл (3 капли). В два параллельных ряда лунок панели, начиная с последнего разведения (1:640) добавляют по 1 капле исследуемой сыворотки. Затем во все лунки вносят по 1капле стабилизирующего раствора. После чего в 1 ряд лунок добавляют по 1 капле эритроцитарного диагностикума КГЛ, во второй ряд по 1 капле гетерологичного диагностикума (для контроля). Дополнительно ставят контроль эритроцитарного диагностикума КГЛ и гетерологичного на отсутствие спонтанной агглютинации. Для этого в лунки вносят по 2 капле стабилизирующего раствора и по 1 капле эритроцитарного диагностикума;

5) Оценка результатов:

оценку результатов РНГА производят через 1,5-2 часа (далее – ч) экспозиции опыта при комнатной температуре по наличию или отсутствию агглютинации эритроцитов. Агглютинация эритроцитов представлена однородной пленкой эритроцитов на дне лунки. Отсутствие агглютинации – образование эритроцитов в виде компактной точки на дне лунки.

46. Титром АГ считается то его наивысшее разведение, которое вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов. РНГА оценивают как положительную при условии, что 1) диагностикум не дает спонтанной агглютинации (диагностикум ККГЛ и гетерологичный); 2) отсутствие спонтанной агглютинации исследуемой сыворотки с гетерологичным диагностикумом.

47. Выявление специфических АТ в реакции связывание комплемента (далее-РСК) исследуют парные сыворотки крови: 1 пробу крови, взятую на 1-2 день обращения за медицинскую помощь, 2 пробу – на 2-3 недели от начала заболевания. В случае отсутствия АТ может быть проведено исследование 3 пробы крови через полтора-два месяца от начала болезни. Комплементсвязывающие антитела к вирусу ККГЛ появляются через 2 недели от начала заболевания и продолжительность сохранения их составляет свыше 3-5 лет. РСК ставит микрометодом согласно методических рекомендаций, выпущенных Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и инфекционных болезней (Микрометод РСК в диагностике вирусных и риккетсиозных инфекций Алматы).

48. Необходимые реагенты для постановки иммуноферментного анализа (далее-ИФА):

1) планшет для ИФА, в лунках которого адсорбирован АГ к вирусу ККГЛ или АТ к вирусу ККГЛ;

2) положительная и отрицательная контрольные сыворотки;

3) инактивированный АГ ККГЛ;

4) моноклональные АТ к нуклеопротеину вируса, конъюгированные с ферментом;

5) субстрат, буферные растворы и разбавитель. Необходимые материалы, не включенные в набор;

6) автоматические пипетки объёмом 10, 100, 200 и 1000 микролитров (далее-мкл);

7) аппарат для промывки планшетов;

8) спектрофотометр для ИФА с длиной волны 450 нанометров (далее-нм);

9) калькулятор для количественной оценки результатов исследования.

49. На первой стадии анализа исследуемые и контрольные образцы инкубируют в лунках с иммобилизованным АГ (или АТ). Имеющиеся в сыворотке специфические АТ к вирусу связываются с иммобилизованным АГ (АТ). Несвязавшийся материал удаляют отмывкой. Связавшийся комплекс выявляют при инкубации с конъюгатом АТ к ККГЛ человека с пероксидазой хрена. После второй отмывки количество связавшегося конъюгата определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы – перекиси водорода и хромогена – тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением стоп-реагента и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 450 нм.

50. Оценка результата: интенсивность окрашивания пропорциональна количеству содержащихся в исследуемом образце иммуноглобулинов к вирусу ККГЛ.

51. ИФА для выявления иммуноглобулинов (далее – Ig ) класса М (Ig M) к вирусу ККГЛ. Принцип метода заключается во взаимодействии Ig класса М из исследуемого материала с анти – IgM- АТ, иммобилизированными в лунках полистиролового планшета. Образовавшийся комплекс выявляют с помощью АГ ККГЛ и конъюгата поликлональных АТ к ККГЛ с пероксидазой хрена.

52. ИФА для выявления Ig класса G к вирусу ККГЛ. Имеющиеся в сыворотке специфические АТ к вирусу связываются с иммобилизованным АГ. Связавшиеся антитела выявляют конъюгатом АТ к IgG человека с пероксидазой хрена.

53. ИФА для выявления вируса ККГЛ в клещах и других вирусосодержащих материалах. Принцип метода заключается во взаимодействии АГ ККГЛ из исследуемого материала с АТ, иммобилизированными в лунках полистиролового планшета. Связавшийся АГ выявляют с помощью анти-ККГЛ-АТ, меченных пероксидазой хрена (конъюгат). По завершении постановки теста развивается окрашивание, свидетельствующее о присутствии АГ ККГЛ в образце (хромоген).

54. Молекулярно-биологические методы – ПЦР. Проведение лабораторной диагностики ККГЛ в первые дни заболевания необходимо как для своевременной и адекватной терапии больного, так и для экстренного проведения противоэпидемических мероприятий. В ряде случаев при ККГЛ наблюдается низкая АГ нагрузка вируса в крови (начальные стадии инфекции, инаппарантная форма, поздняя обращаемость), что делает невозможным проведение серологических методов исследования. Обнаружение рибонуклеиновой кислоты (далее-РНК) вируса ККГЛ в биологическом и клиническом материале с помощью ПЦР в последнее время находит все более широкое применение. Опубликованы ряд методик для ПЦР-диагностики ККГЛ (1,2,3), основанный на специфической амплификации участка гена, кодирующего нуклеопротеина и расположенного в области малого сегмента РНК вируса ККГЛ.

55. Для проведения анализа необходимо следующее оборудование:

1) амплификатор;

2) центрифуга лабораторная;

3) ультрафиолетовая подсветка (трансиллюминатор) с фотоштативом, защитным экраном, в комплексе с фотоаппаратом;

4) прибор для электрофореза с зажимами и гребёнкой;

5) высоковольтный источник питания;

6) встряхиватель для пробирок типа;

7) снежная или льдо-водяная баня;

8) набор автоматических микропипеток с переменным объёмом;

9) наконечники с фильтрами к микропипеткам;

10) пробирки конические полипропиленовые, 1,5 и 0,5 мл и штативы к ним.

56. Тест-системы предназначены для выявления РНК вируса КГЛ в гомогенатах клещей, в крови заболевших людей, в секционном материале умерших (печень, селезёнка). Наборы рассчитаны на проведение 100 анализов, включая положительный и отрицательный контроли.

57. Состав набора:

1) стандарт РНК возбудителя КГЛ – 300 мкл;

2) реакционная смесь (далее-РС) № 1– 600 мкл;

3) РС № 2 – 1200 мкл;

4) РС № 3 – 1200 мкл;

5) вода дистиллированная, очищенная от РНК-аз и ДНК-аз – 2 мл;

6) раствор хлористого марганца – 120 мкл;

7) раствор ДТТ – 230 мкл;

8) буферный раствор обратной транскриптазы (далее-БФ-РТ) – 800 мкл;

9) масло минеральное – 5 мл;

10) раствор Tag-ДНК-полимеразы (2 x БФ) – 3,8 мл;

11) маркер длины фрагментов дезоксирибонуклеиновой кислоты (далее-ДНК) (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 пар оснований) – 50 мкл.

58. В связи с высокой чувствительностью метода ПЦР возникает проблема взаимной контаминации исследуемых образцов и контаминации образцов и компонентов набора ранее полученным ампликоном.

59. Территориально разделять различные стадии анализа, размещая их в различных помещениях:

1) помещение для подготовки проб;

2) помещение для постановки ПЦР;

3) помещение для анализа результатов.

60. Для каждой стадии анализа должен быть свой комплект лабораторной одежды, автоматических пипеток, вспомогательных материалов и оборудования.

61. Работу на всех этапах проводить только с использованием одноразовых расходных материалов: пробирок, наконечников с фильтрами (для ПЦР-анализа) и других вспомогательных материалов.

62. Метод обратной транскриптазы (далее-ОТ) –ПЦР включает два этапа: на первом этапе при температуре 37°С происходит реакция ОТ: специфическое связывание олигонуклеотида-праймера с вирусной РНК и синтез вирусной к ДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). На втором этапе проводится ПЦР, включающая три стадии:

1) на первой стадии при температуре 94°С происходит денатурация гибридной двойной цепи РНК- к ДНК, образовавшейся на первом этапе;

2) на второй стадии ПЦР два олигонуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к определённым участкам антипараллельных цепей вирусной РНК и к ДНК, связываются (образуют гибриды с помощью водородных связей) с этими участками нуклеиновой кислоты (далее-НК) (стадия отжига);

3) на третьей стадии при температуре 70-72 °С с участием термофильной ДНК-полимеразы и дезоксинуклеозид-5ў-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с вирусной к ДНК, матрицей для синтеза служат исходные цепи вирусной НК (стадия полимеризации).

63. Таким образом, за цикл (три стадии) происходит удвоение каждой из двух антипараллельных цепей вирусной НК. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества исходной ДНК примерно в миллион раз.

64. Для увеличения чувствительности анализа этап ПЦР проводится в “nested”-варианте: первый раунд – с “внешней” парой олигонуклеотидов-праймеров, второй раунд – с “внутренней” парой олигонуклеотидов-праймеров и аликвотой реакционной смеси ПЦР первого раунда.

65. Перед выполнением анализа необходимо внимательно ознакомиться с настоящей инструкцией постановки ПЦР.

66. При подготовке смесей и всех операциях с РНК для лучшей сохранности РНК пробирки обязательно помещать в снежно-водяную баню.

67. Подготовка образцов – в качестве образцов можно использовать клещей, цельную кровь, взятую с антикоагулянтом, сыворотку крови.

68. Анализ проводится непосредственно после забора проб. В ином случае забранные пробы до проведения анализа должны хранить при температуре 2-4°С не более 24 ч, либо при температуре минус 30 °С не более 1 месяца.

69. Подготовку проб проводить в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов для выделения РНК.

70. Подготовка стандартного раствора РНК вируса КГЛ – из пробирки с водно-спиртовой суспензией РНК после перемешивания на встряхивателе отобрать 50 мкл суспензии, перемешать, выдержать 5 минут (далее – мин), отцентрифугировать при 8000-10000 об./мин 5 мин, супернатант отобрать, осадок подсушить и добавить к нему 50 мкл воды из набора, растворить при встряхивании.

71. Во многих случаях осадок выделенной РНК визуально неразличим, поэтому все операции по осаждению РНК и промывке осадка проводить аккуратно.

72. Проведение ОТ – пробирки для проведения ОТ пронумеровать и расположить в штативе во льду, включая две пробирки для положительного и отрицательного контрольных образцов (далее-К+, К–).

73. В чистую пробирку внести необходимые компоненты реакционной смеси:

1) раствор ДТТ – 2,0 х n мкл;

2) раствор хлористого марганца – 1,0 х n мкл;

3) БФ-РТ – 7,0 х n мкл;

4) РС № 1 – 5,0 х n мкл;

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

74. Смесь перемешать пипетированием и разнести по 15 мкл в пробирки для ОТ, на льду.

75. В пробирку № 1 внести 5 мкл К– (дистиллированной воды, очищенной от РНК-аз и ДНК-аз). В остальные пробирки внести по 5 мкл раствора РНК исследуемых образцов. В последнюю пробирку внести 5 мкл К+.

76. Пробирки инкубировать 1 ч при температуре 42°С.

77. Проведение первого раунда ПЦР – пробирки для проведения ПЦР (вместимостью 0,5 мл) пронумеровать и расположить в штативе, включая пробирки для контрольных образцов, во льду.

78. В чистую пробирку объемом 0,5 мл добавить реактивы в следующих количествах:

1) 2 х БФ – 15,0 х n мкл;

2) РС № 2 – 10,0 х n мкл,

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

79. Смесь перемешать пипетированием и разнести по 25 мкл в пробирки для ПЦР. В пробирку № 1 добавить 5 мкл раствора из реакционной смеси К–. В остальные пробирки внести по 5 мкл ОТ-продуктов исследуемых проб. В последнюю пробирку внести 5 мкл ОТ-продуктов К+. Содержимое пробирок перемешать, добавить по 20 мкл (каплю) минерального масла.

80. Пробирки поместить в амплификатор и провести амплификацию по следующей программе:

1) 94°С – 3 мин – 1 цикл;

2) 94°С – 20 секунд (далее – сек), 55°С – 20 сек, 72°С – 20 сек– 35 циклов;

3) 72°С – 3 мин – 1 цикл.

81. Проведение второго раунда ПЦР– пробирки для проведения ПЦР пронумеровать как для стадии первого раунда ПЦР. Расположить в штативе во льду, включая пробирки для положительного и отрицательного контрольных образцов (К+, К–).

82. В отдельной пробирке объемом 0,5 мл смешать:

1) 2хБФ — 15,0 х n мкл;

2) РС № 3 – 10,0 х n мкл,

где n – число исследуемых проб, включая контроли.

83. Полученную смесь тщательно перемешать и разнести по 25 мкл в пробирки для ПЦР. Внести во все пробирки по 5 мкл растворов из пробирок 1-го раунда ПЦР.

84. Материал из пробирки, содержащий К+, перед проведением второго раунда ПЦР следует развести в 50 раз дистиллированной водой, затем внести 5 мкл в РС.

85. Содержимое пробирок перемешать, добавить по 20 мкл (каплю) минерального масла, поместить пробирки в амплификатор и провести амплификацию по следующей программе:

1) 94° С – 3 мин– 1 цикл;

2) 94° С – 20 сек, 55°С – 20 сек, 72°С – 20 сек – 35 циклов;

3) 72° С – 3 мин – 1 цикл.

86. Детекцию амплифицированной ДНК после ПЦР проводить методом гель-электрофореза в 1,5% агарозе. В один из карманов геля внести раствор маркера длины фрагментов ДНК. Материалы, необходимые для проведения электрофореза:

1) агароза;

2) раствор бромистого этидия, 1 %;

3) 50-кратный ТАЕ-буфер – 50 xТАЕ-2М Трис-ацетат рН 8,2, 0,05 М ЭДТА;

4) 10-кратный буфер для нанесения образцов (50%-ный глицерин, 0,25%-ный бромфеноловый синий, 0,25%-й ксиленцианол).

87. Проведение электрофореза. Залить в аппарат для электрофореза 1хТАЕ-буфер, приготовленный из 50хТАЕ разбавлением водой. К 100 мл 1х ТАЕ-буфера добавить 1,5 г агарозы, расплавить агарозу на электрической плите, добавить 100 мкл раствора бромистого этидия, перемешать. Залить агарозный гель согласно инструкции к аппарату для горизонтального электрофореза. Для заливки геля можно использовать крышки от иммунологических планшет подходящего размера. Для получения карманов в агарозном геле установить гребёнку на крышку для планшет с помощью зажимов типа “бульдог”. Охладить агарозу до температуры 50-60 °С и налить на планшет. Внести в карманы геля по 10-15 мкл амплификата. В один карман внести 5 мкл маркера длин фрагментов ДНК. Подключить электрофоретическую камеру к источнику питания и задать напряжение 10-15 В/см геля. Провести электрофорез продуктов амплификации в направлении от катода (–) к аноду (+). Оптимальная длина пробега 5-7 см. Вынуть гель из формы и перенести его на стекло трансиллюминатора.

88. С гелем агарозы работать в перчатках, так как бромистый этидий является сильным мутагеном.

89. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся оранжево-красных полос. Проводить электрофоретический анализ продуктов ПЦР как после I раунда, так и после II раунда. При высокой вирусной нагрузке детекция ПЦР-продукта возможна уже после I раунда ПЦР, в этом случае после II раунда ПЦР в геле может отсутствовать специфическая полоса.

90. Тест-системы хранятся при температуре 2-10 °С. Транспортирование осуществляются всеми видами крытого транспорта в термоконтейнерах с термопакетами с хладагентом. Срок годности тест-систем — 4 месяца со дня выпуска.