Токсикологическое воздействие ДХ на организм
Газообразный ДХ обладает мощным антимикробным действием в очень низкой концентрации. Так, было продемонстрировано, что антимикробное действие газообразного ДХ проявляется при концентрации от 0,01 до 0,03 мг/м³ [4–5]. При этом остается неизвестным, является ли безопасным хроническое воздействие газообразного ДХ на организм в концентрациях, эффективных для борьбы с микроорганизмами. В этой связи было выполнено исследование ингаляционной токсичности ДХ в низкой концентрации при долговременном воздействии на экспериментальных животных. При ингаляции ДХ в первую очередь воздействию подвергаются верхние дыхательные пути, соответственно было изучено воздействие ДХ на эпителий трахеи и легких. Наконец, воздействие ряда химически активных веществ на органы дыхания практически всегда сопровождается окислительным стрессом в этих органах [6, 7]. Для нейтрализации негативных последствий в органе активируются различные звенья антиоксидантной системы [8], поэтому исследуя динамику экспрессии генов ферментов-антиоксидантов органа, мы можем характеризовать как сам окислительный стресс, так и основные звенья, ответственные за его нейтрализацию.
Материалы и методы
В экспериментах были использованы крысы линии «Вистар» мужского пола весом 200-220 г. В качестве источника ДХ был применен серийный обеззараживатель воздуха (генератор ДХ)
Животных помещали в клетки, расположенные в камере размером 75 х 75 х 80 см при температуре 24°C и относительной влажности воздуха 7 %, с 12-часовым циклом чередования светлого и темного времени суток. Генератор ДХ был расположен на расстоянии 25 см от верха клеток. Животных выдерживали в атмосфере ДХ в течение определенного времени. В случае суточных экспериментов через 5 ч после каждого воздействия генератор ДХ из камеры удаляли. При исследовании хронического воздействия ДХ генератор находился в камере в течение всех 30 дней.
Все эксперименты над животными проводили в строгом соответствии с требованиями Руководства по обращению с лабораторными животными РФ и Руководством по работе с животными сотрудниками ИБК РАН (утверждено приказом директора ИБК РАН № 57 от 30.12. 2011).
Перед забоем животных наркотизировали путем внутрибрюшинного введения раствора диэтилбарбитуровой кислоты из расчета 10 мг на 100 г массы животного. Выделенную ткань для экспериментов немедленно помещали в жидкий азот. Для одновременного гистологического анализа и анализа экспрессии генов на одном животном в случае трахеи для гистологии брали верхнюю половину трахеи, для анализа уровня экспрессии генов – нижнюю половину трахеи.
Гистологические исследования проводили на парафиновых срезах по стандартной методике. Выделенные образцы ткани закрепляли в фиксаторе Mirsky’sFixative («NationalDiagnostics», США) с последующей проводкой в соответствующих растворах и заключении в парафин. Срезы толщиной 2–5 мкм получали на криотоме HM 325 Microm («ThermoScientific», Германия).и окрашивали гематоксилином-эозином (Hematoxylin-EozinaccordingtoEhrlich, «Fluka», США). Для выявления муцина и клеток, его секретирующих, срезы окрашивали альциановым синим. Дальнейший анализ проводили на световом микроскопе Leica DM 6000 B («LeicaMicrosystems», Германия) с помощью камеры Leica DFC 420 C.
Для определения малоновогодиальдегида (МДА) Предварительно замороженную в кельвинаторе до -80°С ткань (легкие) размалывали до пылеобразного состояния (с использованием жидкого азота). К 100 мг образца добавляли 3 мл 1% H3PO4, 1 мл 0,8% водного раствора тиобарбитуровой кислоты (ТБК), нагревали смесь на кипящей водяной бане в течение 45 мин. После охлаждения добавляли 4 мл н-бутанола и отделяли слой бутанола путем центрифугирования. Оптическую плотность определяли при длине волны 535 нм по сравнению с контрольными образцами без добавления ткани.
В трахее и легких анализировали экспрессию генов для 15 основных ферментов-антиоксидантов: глутатионпероксидаз 1–8, пероксиредоксинов 1–6, супероксиддисмутаз 1–3 и каталазы. Также исследовали уровень экспрессии генов для маркера апоптоза клеток (сaspase-3) и клеточного маркера пролиферации клеток (Ki-67). Использовали ген-специфическиепраймеры, синтезированные согласно их последовательностям в GenBank. Уровень экспрессии определяли методом ОТ ПЦР (обратная транскрипция + ПЦР) в реальном времени. Нормирование проводили относительно гена фактора элонгации EFIα или гена β-актина – Аctb.
Статистический анализ выполняли с использованием программы SigmaPlot 11.0 Sortware. Результаты выражали как среднее значение (М) ± стандартная ошибка (m). Показатели считали статистически достоверными при p Результаты