Практические навыки. Этапы приготовления мазка со скошенного агара

1)Препараты для микроскопического исследования готовят на чистых предметных стеклах, обезжиривая их поверхность мылом с последующим его удалением сухой негигроскопичной ватой. Наносят на обезжиренную поверхность стекла каплю воды (на хорошо обезжиренном стекле капля растекается).
2) Бактериальную петлю стерилизуют прокаливанием докрасна в пламени горелки. Стерильную петлю используют для взятия микробной массы, держа ее в правой руке, как карандаш. Пробирку или колбу с питательной средой берут в левую руку так, чтобы поверхность с ростом культуры была обращена вверх, вынимают пробку из сосуда мизинцем правой руки, прижимая ее к ладони. Края сосуда обжигают в пламени горелки, вводят в него прокаленную петлю, прикасаясь ею к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, свободной от роста микроорганизмов, с целью охлаждения петли. Захватывают небольшое количество микробной массы, равномерно эмульгируя ее в капле воды в виде кружка или овала диаметром около 1 см. Снова обжигают края сосуда и закрывают его. Петлю стерилизуют.
3) Высушенный мазок в целях умерщвления микробных клеток и прикрепления их к стеклу фиксируют. Обычно применяют физический метод - фиксацию мазка над пламенем горелки или спиртовки троекратно (по 1 сек) мазком вверх. Ни в коем случае стекло не следует перегревать и не подвергать фиксации влажный мазок. Это приводит к деформации и резкому уменьшению размеров и без того мелкого объекта исследования. Химический метод фиксации более щадящий. Используют этанол (10—15 мин), ацетон (5 мин), смесь Никифорова (смесь равных объемов этанола и эфира—10— 15 мин), метанол (3 мин), пары осмиевой кислоты, формалин (несколько секунд).

№8

29. Споры и капсулы у бактерий: образование, значение, методы изучения

Капсула. Капсула бактерий – это утолщенный наружний слой клеточной

стенки. Капсулы могут быть построены из полисахаридов ( пневмококк) или белков

(возбудитель сибирской язвы ). Большинство бактерий , особенно патогенных,

образуют капсулу только в организме человека или животных. Однако , существует

род истинно капсульных бактерий (Klebsiella), представители которого образуют

капсулу и при культивировании на искусственно питательных средах. Некоторые

бактерии могут иметь микрокапсулу, например, эшерихии, или неявно выраженную

способность к капсулообразованию – так называемую « нежную « капсулу, напимер

золотистые стафилококки, менингококки.

Функции капсулы:
- место локализации капсульных антигенов, определяющих вирулентность, антигенную специфичность и иммуногенность бактерий;
- защита клеток от механических повреждений, высыхания, токсических веществ, заражения фагами, действия защитных факторов макроорганизма;
- способность прикрепления клеток к субстрату.

Выявление капсулы по методу Гинса:
1. На предметное стекло наносят каплю туши, а рядом – каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно перемешивают и с помощью шлифованного стекла готовят мазок.
2. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют на пламени горелки.
3. Мазок окрашивают фуксином в разведении 1:3 или сафранином. При этом бактерии окрашиваются в красный цвет, капсулы остаются неокрашенными и выделяются на темном фоне препарата.

Окраска капсулы по Романовскому-Гимзе происходит по следующей технологии:

1.На предметное стекло наносится мазок разведенной чистой культуры.

2.Стекло устанавливается мазком вниз в чашку Петри на стеклянные подставки.

3.В чашку Петри добавляют 20 капель краски Романовского-Гимзе.

4. Через 15-20 минут предметное стекло промывают и высушивают.

В результате бактерии окрашиваются в темно-синий цвет, а капсулы приобретают розовую окраску.

Споры бактерий. Споры бактерий представляют собой бактериальные клетки

в состоянии анабиоза и образуются при неблагоприятных условиях внешней среды.

Располагаться могут внутри клетки терминально , субтерминально или центрально.

В процессе спорообразования клетка почти полностью теряет воду,

смарщивается, клеточная стенка уплотняется, появляется новое вещество дипиколинат

кальция которое образует комплексы с биополимерами клетки, устойчивые к

действию температуры и ультрафиолетовых лучей. В окружающей среде споры

бактерий могут сохраняться годами, но при попадании в благоприятные условия спора

впитывает влагу, комплексы распадаются, дипиколинат разрушается и спора

превращается в вегетативную клетку.

Таким образом, спору следует рассматривать не как способ размножения

клетки(как это часто имеет место у грибов ), а только как способ существования

бактериальной клетки в неблагоприятных условиях. При этом надо запомнить – 1

клетка- 1спора.

Спорообразование характерно в основном для Гр(+) бактерий. У Гр(-)

эквивалентом спорообразования является переход в так называемое некультивируемое

состояние. В такой форме они могут длительно сохраняться в окружающей среде.

Окраска спор по методу Ожешки:
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% раствор хлористоводородной кислоты и подогревают на пламени горелки в течение 2-3 минут.
2. Кислоту сливают, препарат промывают водой, просушивают и фиксируют над пламенем горелки.
3. Окрашивают препарат по Цилю-Нильсену. Споры бактерий при этом приобретают красный цвет, а вегетативные формы – синий.

30. Инфекция, инфекционная болезни, носительство – написать определения. Особенности инфекционных болезней

Инфекция - Это реакции, которыми макроорганизм отвечает на внедрение микроорганизма. Они могут быть разнообразны и многочисленны. На одном полюсе реакции, которые не имеют клинических проявлений, образ жизни человека не меняется – внешних проявлений нет. А на другом полюсе – реакции, которые в

считанные часы, дни приводят к гибели человека, настолько они не совместимы.
Инфекционная болезнь (И.Б.) – клиническое проявление инфекции.

Особенности инфекционных болезней:

1) имеют своего возбудителя- это микробные агенты;

2) передается от больного к здоровому;

3) оставляют после себя более или менее выраженную

невосприимчивость к повторному заболеванию;

4) имеют общие клинические симптомы;

5) имеют строгое циклическое течение.

Носительство — одна из форм инфекционного (инвазионного) процесса, при которой паразитирование возбудителей заразных болезней в организме человека и животного протекает без клинических проявлений и сопровождается выделением возбудителя в окружающую среду.

31. Реакции с мечеными сыворотками ИФА по обнаружению антител.

Одними из широко используемых в настоящее время реакций иммунитета

являются реакции ИФА, в которых участвуют диагностические сыворотки, антитела

которых несут на себе ферментные метки.

Среди вариантов постановки ИФА чаще применяют твердофазный метод.

Известный компонент реакции (АГ или АТ) адсорбирован на полимерном носителе (лунке планшета). Как любая реакция иммунитета ИФА может быть использован для

обнаружения АТ – диагностическая реакция

В этом случае в лунках иммунологического планшета сорбирован известный АГ (к которому ищут АТ). На него наслаивается исследуемая сыворотка в разведениях. Если она содержит соответствующие АТ, то образуется комплекс АГ-АТ. Для его визуализации в лунку добавляется антиглобулиновая сыворотка (АГС), меченная ферментом. Образуется комплекс АГ-АТ-АГС, меченная ферментом. На заключительном этапе добавляется субстрат для фермента, которым помечена АГС. Антиглобулиновая сыворотка получается

путем иммунизации животных (чаще кроликов) γ-глобулинами человека. Реакция

фермент – субстрат проявляется изменением окраски.

32. Практичекие навыки. Характеристика колоний. Дайте определение понятию «колония»

Колония – это видимое невооруженным глазом изолированное скопление бактерий,являющееся потомством одной клетки на поверхности твердой питательной среды. Т.о., колония – это чистая культура бактерий.

Характеристика:
- Общую характеристику роста – однородный или неоднородный;

- Изучение выросших колоний – для этого отбирают по 1 колонии каждого типа,

обводят их со стороны дна чашки карандашом по стеклу, нумеруют и описывают по схеме:

1. Макроскопически (невооруженным глазом):

А) В проходящем свете

Для этого чашку Петри поднимают дном к себе так, чтобы свет проходил через толщу питательной среды. В проходящем свете описывают:

- Форму (правильная или неправильная);

- Величину (точечная – до 1 мм, мелкая – 1-2 мм, средняя 2-4 мм, крупная 4-6

мм);

- Прозрачность (прозрачная, полупрозрачная или непрозрачная).

Б) В отраженном свете

Чашку открывают для того, чтобы свет отражался от поверхности колоний. В

отраженном свете описывают:

- Высоту (плоская, плоско-выпуклая или выпуклая);

- Поверхность (гладкая, блестящая или матовая, шероховатая);

- Цвет (цвета среды – неокрашенная или пигментированная – окрашенная в

тот или иной цвет).

2. Микроскопически (при малом увеличении, сухой объектив)

Чашку помещают на столик микроскопа вверх дном. Микроскопически описывают:

- Края (ровные или неровные);

- Структуру (гомогенная - однородная, негомогенная - неоднородная,

зернистая, гирозная).

№9

33. Органеллы движения у бактерий и методы их изучения. Пили бактерии и их функции
На поверхности ряда бактерий располагаются жгутики. В их состав

входит белок флагеллин, который по своей структуре относится к сократимым белкам

типа миозина.Поэтому жгутики обеспечивают подвижность бактерий. Количество и

расположение жгутиков у разных бактерий неодинаково Монотрихи – имеют на

одном из полюсов клетки только один жгутик, лофотрихи – пучок жгутиков ,у

амфитрихихов жгутики расположены на обеих полюсах клетки, а у перетрихов – про

всей поверхности

Наличие жгутиков можно обнаружить при помощи внесения бактерий уколом в столбик полужидкого агара – подвижные растут по всей толще среды, неподвижные – по уколу.
Пили (ворсинки). Прямые нитевидные образования, обнаруженные у сальмонелл, эшерихий, протея, называют ворсинками, а также бахромками, фимбриями, ресничками, пилями (рис. 8). Пили тоньше жгутиков бактерий и короче их; состоят из особого белка пилина, мономеры которого, как и у жгутиков, расположены по спирали. Пили различаются по диаметру и длине; толщина пилёй может быть от 4—10 до 35 нм. Количество пил ей на одну бактериальную клетку может достигать нескольких сотен. Пили обеспечивают способность бактерий к прилипанию (адгезия) друг к другу или к субстрату, например к эпителиальным клеткам слизистой оболочки кишечника. Некоторые пили, например F-ворсинки, выполняют половые функции у бактерий. Они обеспечивают передачу наследственного материала (ДНК) из одной бактериальной клетки в другую, образуя мостик между двумя клетками. Эти ворсинки шире и длиннее остальных и на конце имеют шаровидное утолщение.