Изучение активности гуморальных факторов врожденного иммунитета (продолжение)
Вопросы для подготовки
1. Общее представление о цитокинах. Их основные группы. Цитокиновая сеть и принципы ее функционирования.
2. Провоспалительные цитокины (ИЛ-1, ФНО-α, ИЛ-6 и др.). Структура, клетки-продуценты, мишени, роль в иммунитете.
3. Противовоспалительные цитокины. Структура, клетки-продуценты, мишени, роль в иммунитете.
4. Интерфероны, классификация, структура, клетки-продуценты, мишени, роль в иммунитете.
5. Цитокиновые рецепторы. Сигнальные пути при действии на клетку цитокинов.
6. Апоптоз, его виды. Механизмы запуска апоптоза, роль цитокинов семейства ФНО и белков Вcl-2.
7. Каспазы, особенности строения и роль в апоптозе.
8. Использование цитокинов в клинике. Препараты интреферонов I типа и интерфероногены. Примеры.
9. Заполнить таблицу «Функции цитокинов»:
Распределить следующие цитокины по функциональному назначению и роли в иммунном ответе: IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, CXCL-8, TNF-α, β, IFN-α, IFN-γ, TGF-β.
| Активность цитокинов | Представители |
| Провоспалительные | |
| Противовоспалительные | |
| Активация фагоцитов | |
| Подавление активности фагоцитов | |
| Активация В-лимфоцитов | |
| Активация Т-лимфоцитов | |
| Подавление иммунного ответа |
Практическая работа
З а д а н и е №3
Определить титр комплемента в сыворотках морской свинки и человека по реакции иммунного гемолиза. Учесть полученные результаты и данные занести в таблицу. Оформить протокол. Сделать заключение.
| Сыворотка человека, мл | 0,5 | 0,4 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | К |
| Физ. раствор, мл | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,9 | ? | |
| Гемолитическая система, мл | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ? |
| Инкубация 45 мин, 37°С | ||||||
| Результат | ||||||
| Сыворотка морской свинки, мл | 0,5 | 0,4 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | ? |
| Физ. раствор, мл | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,8 | 0,9 | ? |
| Гемолитическая система, мл | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ? |
| Инкубация 45 мин, 37°С | ||||||
| Результат |
«+» – гемолиз (лаковая кровь), «–» – отсутствие гемолиза
М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я
Сыворотки морской свинки и человека последовательно разводят физиологическим раствором (как указано в таблице). К каждому разведению сыворотки добавляют 3%-ную взвесь эритроцитов барана и инактивированную гемолитическую сыворотку (гемолитическая система). Пробирки ставят в термостат на 45 мин при 37°С. Учет производят по наличию полного гемолиза. Сыворотка человека используется неразведенная, а сыворотка морской свинки предварительно разводится в 10 раз.
Титром комплемента называется его минимальное количество, вызывающее полный гемолиз.
Занятие №5
Антитела. Главный комплекс гистосовместимости
Методы получения антител. Определение концентрации иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии. НLA-типирование
Вопросы для подготовки
1. Общий план строения иммуноглобулина. Константные и вариабельные домены иммуноглобулинов. Изотипы иммуноглобулинов. Понятие об аллотипах и идиотипах.
2. Строение вариабельных доменов иммуноглобулинов. Гипервариабельные участки. Структура антигенсвязывающих участков.
3. Физические силы, участвующие во взаимодействии антигена с антителом. Аффинность взаимодействия антигена и антитела.
4. Иммуноглобулины классов (G, M, А, D и E), особенности строения и биологические функции.
5. Секреторный IgA. Синтез и роль в защите слизистых оболочек.
6. Эффекторные функции антител. Нейтрализация, опсонизация, комплементзависимый цитолиз. Значение изотипов антител.
7. Гибридомы и моноклональные антитела. Области применения.
8. Кинетика синтеза антител. Первичный и вторичный иммунный ответ. Механизм переключения изотипов антител при иммунном ответе.
9. Методы количественного определения иммуноглобулинов (радиальная иммунодиффузия по Манчини).
10. Главный комплекс гистосовместимости (МНС). Генетическая структура локуса. Гены МНС I, II и III классов.
11.Строение молекул МНС I и II классов. Антигенсвязывающая щель и ее роль в иммунном ответе.
12. Методы исследования и типирования HLA (ПЦР, ДНК-гибридизация).
13. HLA и заболевания человека, механизмы.
14. Схематично нарисовать в тетради структуру молекулы IgG, подписать все фрагменты, цепи и домены.
15. Заполнить таблицу «Классы иммуноглобулинов»:
| Класс Ig | Строение | Свойства |
| IgМ | ||
| IgG | ||
| IgA | ||
| IgE | ||
| IgD |
16. Заполнить таблицу «Антиген-представляющие молекулы»:
| Свойства молекул | МНС I | МНС II | Другие |
| Клеточное распределение | |||
| Локализация в клетке | |||
| Тип эпитопа | |||
| Место и условия связывания с эпитопом |
Практическая работа
З а д а н и е №1
Определить уровни иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови обследуемых А. и В. методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. Оформить протокол в виде рисунка с обозначениями и графика. Сделать заключение.
М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я
Три порции расплавленного 3%-ного агара смешивают в соотношении 1:1 соответственно с антиглобулиновыми сыворотками против IgM, IgG и IgА. Этими смесями покрывают три стеклянные пластины. В застывшем агаре каждой пластины делают лунки, в которые вносят по 0,2 мкл стандартной сыворотки с известным содержанием иммуноглобулинов трех классов (М, G и А): неразведенной, и в разведениях 1:2, 1:4, 1:6 и 1:8. В другие лунки каждой пластины вносят испытуемые сыворотки, взятые от обследуемых людей, в которых хотят определить содержание IgM, IgG и IgА. После суточного выдерживания во влажной камере при 4°С измеряют диаметры образовавшихся колец преципитации с разведениями стандартной сыворотки на каждой из трех пластин и строят калибровочные кривые, отражающие концентрацию IgM, IgG и IgА в этой сыворотке (dзоны=f(СIg)). Затем измеряют диаметры колец с исследуемой сывороткой (на трех пластинах) и по калибровочным кривым определяют концентрацию IgM, IgG и IgА в сыворотках обследуемых.
Исходный уровень содержания иммуноглобулинов в стандартной сыворотке:
IgG – 8,41 мг/мл (133 МЕ/мл)
IgM – 1,12 мг/мл (109 МЕ/мл)
IgA – 1,55 мг/мл (104 МЕ/мл)
З а д а н и е №2
Используя готовые демонстрации познакомиться с методикой проведения HLA-типирования. Оформить протокол в виде рисунка. Ответить на вопросы:
1. Как получают сыворотки для HLA-типирования?
2. Как защитить содержимое лунок от высыхания в процессе постановки реакции?
3. Когда и с какой целью проводят HLA-типирование?
М е т о д и ч е с к и е у к а з а н и я
Суспензию лимфоцитов смешивают с антисывороткой к определенному антигену (HLA-В8, HLA-B27 и т.д.), инкубируют 1 час при 25°С, добавляют комплемент и инкубируют вновь 2 ч при 37°С, а затем добавляют трипановый синий или эозин. В случае присутствия в лимфоцитах антигена, соответствующего антителам, содержащимся в сыворотке, антитела в присутствии комплемента повреждают мембрану лейкоцитов, краска проникает в их цитоплазму и они окрашиваются в синий или же красный цвет (если используется эозин).