Определение лекарственной резистентности
С помощью существующих тестов возможно определение фенотипической и генотипической лекарственной резистентности.
Определение фенотипической лекарственной резистентности предполагает установление способности ВИЧ выживать при различных концентрациях АРВ препаратов in vitro (резистентность констатируется, если IC50 мутантного вируса превышает IC50 дикого вируса более чем в 5-7 раз).
Определение генотипической лекарственной резистентности предполагает регистрацию присутствия в геноме ВИЧ мутантных генов, наличие которых сопряжено с формированием фенотипической лекарственной резистентности.
Обычно в научно-исследовательских лабораториях определяют фенотипическую резистентность ВИЧ к АРВ препаратам, а затем устанавливают сопряженные с ее развитием мутации резистентности. Полученные данные накапливаются в банке данных и публикуются для последующего их использования в практике.
В клинической практике методами генетического анализа (секвенирование или гибридизация) определяют мутации в геноме ВИЧ и, владея данными о сопряженности той или иной мутации с развитием фенотипической резистентности, проводят так называемое «виртуальное фенотипирование» с выдачей заключения о резистентности ВИЧ к известным АРВ препаратам. Приблизительно в 20% случаев результат получить не удается из-за отсутствия в банке данных достаточного количества пар «генотип-фенотип», необходимых для виртуального фенотипирования исследуемого штамма.
В Беларуси определение генотипической лекарственной осуществляется с помощью метода секвенирования (от англ. sequence – последовательность) – т.е. определения последовательности нуклеотидов в исследуемом участке генома ВИЧ. Этапами постановки метода являются:
§ выделение РНК ВИЧ из образца плазмы крови пациента и накопление РНК ВИЧ с помощью ПЦР;
§ электрофоретическое разделение нуклеотидов РНК ВИЧ и их детекция с помощью различных меток;
§ определение мутаций путем сравнения полученной последовательности нуклеотидов с референс-образцом при помощи компьютерной программы;
§ клиническая трактовка сопряженности выявленных мутаций с развитием резистентности методом «виртуального фенотипирования» при помощи прилагаемой к прибору компьютерной программы или web-ресурсов (доступных на http://www.hopkins-hivguide.org/ или http://hiv-4.stanford.edu/).
Описание мутации включает название аминокислоты дикого вируса, номер кодона мутации и название аминокислоты мутантного вируса. Например, мутация гена обратной транскриптазы К103N означает, что последовательность нуклеотидов в кодоне 103 после мутации соответствует не лизину (К), как у вируса дикого типа, а аспарагину (N). Вирус по отношению к каждому из препаратов классифицируется как чувствительный, умеренно или высоко устойчивый, также возможно применение и более тонкой градации.
Многие специалисты считают, что и методики тестирования, и интерпретация результатов все еще нуждаются в существенном улучшении. Так в клинических испытаниях, в которых сравнивалась эффективность схем «спасения» (то есть назначаемых пациентам, ранее имевшим многократные изменения схем терапии из-за развития их неэффективности), назначенных с учетом результатов исследований резистентности вируса (исследуемая группа) и подобранных в соответствии со стандартными рекомендациями (контрольная группа), были получены разные результаты. В табл. 8 приведены данные о сложностях в проведении и интерпретации тестов для определения резистентности.
Таблица 8 – Сложности в проведении и интерпретации тестов для определения резистентности
| проблема | комментарии |
| определяются только доминантные мутации | доля мутантных вирусов в популяции ВИЧ для их детекции должна быть более 20%; не обнаруживаются резистентные вирусы, которые находятся в крови в виде минорных штаммов (менее 20%) и которые сохраняются в «скрытых резервуарах» (ЦНС, латентные CD4 клетки, половой тракт и т.д.) |
| определяется наличие мутаций только на данный конкретный момент времени | обследование не может быть плановым, а приурочивается к моменту наступления вирусологической неэффективности АРТ и проводится обязательно или на фоне приема препаратов, или в первые 2-3 недели от отмены АРТ |
| необходим определенный минимальный уровень VL у пациента | аналитическая чувствительность теста составляет >500-1 000 копий/мл; в клинической практике обычно обследование проводится при VL не менее 10 тысяч копий/мл |
| имеющиеся тест-системы стандартизованы только для ВИЧ субтипа B | возможности применения данных тестов для исследования резистентности штаммов ВИЧ других подтипов неизвестны |
| сложности в интерпретации генотипических тестов | обычно требуется доказательство наличия множественных мутаций (исключая резистентность к ламивудину и ННИОТ) |
| сложности в интерпретации фенотипических тестов | пороговые значения чувствительности, определяемые на основании результатов клинических исследований, установлены не для всех препаратов; пороговые значения, установленные для усиленных ритонавиром ИП, справедливы не во всех случаях; фенотипирование менее чувствительно для выявления формирующейся резистентности (смесь штаммов) |
| высокая стоимость | стоимость определения генетической резистентности в Европе составляет около 250-350 ?, фенотипической резистентности – около 600-750 ? |
Для клинической практики предпочтительнее определение генотипической резистентности, чем фенотипической, поскольку информативность этих двух исследований сопоставима, но генотипирование имеет более низкую стоимость и более короткое время получения результатов теста (обычно до 1-2 недель). В Беларуси определение генотипической резистентности проводится с 2007 года.
Предпочтительнее, чтобы интерпретацию теста на резистентность проводил постоянно этим занимающийся специалист, а не лечащий врач – это значимо повышает клиническую ценность использования тестов.
При установлении мутаций резистентности можно констатировать неэффективность отдельных АРВ препаратов и провести изменение АРТ. Но следует помнить, что по результатам теста можно точно сказать, какие препараты назначать в дальнейшем не следует, но сложнее определить оптимальные препараты для последующего лечения.
При повторном назначении АРВ препарата ранее леченному им пациенту следует учитывать не только данные определения резистентности (ведь тест может констатировать «ложную чувствительность» ВИЧ к препарату, который имеет мутации резистентности, но на момент исследования находится в минорном состоянии или сохраняется в департментах), но и данные о клинической эффективности данного препарата при предыдущем его использовании. Повторное назначение препарата, к которому ранее была сформирована резистентность, приведет к переходу мутантных штаммов из минорного состояния в доминирующее и развитию неэффективности лечения.
Не все приводящие к формированию резистентности ВИЧ мутации известны, постоянно появляются новые мутации. Следовательно, результаты генотипирования могут не совпадать с фенотипическими свойствами вируса. Поэтому при необнаружении мутаций резистентности к текущим препаратам у пациента с неэффективностью АРТ, развившейся на фоне высокой приверженности к лечению, по возможности следует определять фенотипическую резистентность.