Раздел 1. Общая микробиология и вирусология.

Раздел 1. Общая микробиология и вирусология.

Место микробиологии и иммунологии в современной медицине.

Микробиология (от греч. micros . малый, bios . жизнь, logos . учение) . наука, изучающая строение, жизнедеятельность и экологию микроорганизмов. Микробиология изучает всех представителей микромира (бактерии, грибы, простейшие, вирусы). По своей сути микробиология является биологической фундаментальной наукой. Как и всякая наука, микробиология подразделяется на общую и частную. Общая микробиология изучает закономерности строения и жизнедеятельности микроорганизмов на всех уровнях . молекулярном, клеточном, популяционном; генетику и взаимоотношения их с окружающей средой. Предметом изучения частной микробиологии являются отдельные представители микромира в зависимости от проявления и влияния их на окружающую среду, живую природу, в том числе человека. В центре внимания клинической микробиологии . роль условно-патогенных микроорганизмов в возникновении заболеваний человека, диагностика и профилактика этих болезней. Вначале иммунология рассматривалась как наука о невосприимчивости организма к инфекционным болезням. В настоящее время она стала общемедицинской и общебиологической наукой. Доказано, что иммунная система служит для защиты организма не только от микробных агентов, но и от любых генетически чужеродных организму веществ с целью сохранения постоянства внутренней среды организма, т.е. гомео-стаза. Иммунология является основой для разработки лабораторных методов диагностики, профилактики и лечения инфекционных и многих неинфекционных болезней, а также разработки иммунобиологических препаратов (вакцин, иммуноглобулинов, иммуномодуляторов, аллергенов, диагностических препаратов). Разработкой и производством иммунобиологических препаратов занимается иммунобиотехнология . самостоятельный раздел иммунологии.

Основные принципы классификации микробов.

Микробы, или микроорганизмы (бактерии, грибы, простейшие, вирусы), систематизи­рованы по их сходству, различиям и взаимо­отношениям между собой. Микроорганизмы представлены доклеточ-ными формами (вирусы — царство Vira) и кле­точными формами (бактерии, архебактерии, грибы и простейшие). По новому высшему уровню в иерархии классификации среди кле­точных форм жизни различают 3 домена (или «империи»): «Bacteria», «Archaea» и «Eukarya»:

- домен «Bacteria» — прокариоты, пред­ставленные настоящими бактериями (эубак-териями);

- домен «Archaea» — прокариоты, пред­ставленные архебактериями;

- домен «Eukarya» — эукариоты, клетки которых имеют ядро с ядерной оболочкой и ядрышком, а цитоплазма состоит из высоко­организованных органелл — митохондрий, аппарата Гольджи и др.

Для обозначения некоторых совокупностей микроорганизмов, отличающихся по тем или иным свойствам, употребляется суффикс var (разновидность). Поэтому микроорганизмы в зависимости от характера различий обозначают как морфо-вары (отличие по морфологии), резистенто-вары (отличие по устойчивости, например, к антибиотикам), серовары (отличие по антиге­нам), фаговары (отличие по чувствительности к бактериофагам), биовары (отличие по био­логическим свойствам), хемовары (отличие по биохимическим свойствам) и т. д.

Для идентификации и типирования бакте­рий используют фенотипические, генотипи-ческие и филогенетические показатели (сущ­ность их описана в последующих главах).

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ: окраска по Граму, морфологические и куль туральные свойства, биохимические реакции, хромогенные ферментативные реакции, ис­пользование источников углевода, антиби-отикограмма, фаготипирование, антигенные свойства, хи­мический состав клеточной стенки, а также белков и липидов клетки.

ГЕНОТИПИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ: гибридизация ДНК, моле­кулярное зондирование, плазмидный анализ, полиморфизм длины фрагментов рестрикции ДНК, риботипирование.

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ: анализ рРНК-последовательности, РНК-РНК-гибридизация, амплификация полимор­фной ДНК с использованием производных праймеров, секвенирование 16S и 23S рРНК.

ОКРАСКА СПОР ПО АУЕСКИ

1. На нефиксированный мазок нанести 0,5% р-р хлороводородной кис-ты и подогреть на пламени в течении 2-3 мин 2. Кислоту слить, препарат промыть водой, просушить и фиксировать над пламенем. Затем окрасить по Цилю-Нельсену.

* Споры бактерий приобретают красный цвет, а вегетативные формы - синий.

ОКРАСКА ПО МЕТОДУ НЕЙССЕРА

1.На фиксированный мазок нанести ацетат синьки Нейссера на 2-3 мин 2. Добавить р-р Люголя на10-30 сек 3. Промыть препарат водой 4. Мазок докрасить водным раствором везувина или хрезоидина в течение 0,5-1 мин 5. Промыть препарат водой, высушить и микроскопировать

* Зерна волютина окрашиваются в темно-миний цвет, цитоплазма – в желтый цвет

Морфология грибов.

Грибы и простейшие имеют четко ограниченное ядро и относятся к эукариотам. Грибы крупнее бактерий, в эволюционном плане близки к растениям (наличие клеточной стенки, содержащей хитин или целлюлозу, вакуолей с клеточным соком, неспособность к перемещению, видимое движение цитоплазмы). Ядерный материал грибов отделен от цитоплазмы ядерной мембраной. Дрожжевые грибы образуют отдельные овальные клетки. Плесневые грибы формируют клеточные нитеподобные структуры- гифы. Мицелий- переплетение гифов- основная морфологическая структура. При вегетативном размножении образуются специализированные репродуктивные структуры- споры- конидии. Они могут располагаться в специализированных вместилищах- спорангиях (эндоспоры) или отшнуровываться от плодоносящих гиф (экзоспоры). Актиномицеты - формы бактерий, имеющие истинный, не имеющий перегородок мицелий. Мицелиальный (в виде ветвящихся нитей) рост этих грамположительных бактерий придает им внешнее сходство с грибами. Это сходство усиливается вследствие наличия у высших форм актиномицетов наружных неполовых спор, которые называются конидиями.В отличие от грибов, актиномицеты имеют прокариотическое строение клетки, не содержат в клеточной стенке хитина или целлюлозы, размножаются только бесполым путем. Представители рода Mycobacterium, в который входят возбудители туберкулеза, являются кислотоустойчивыми микроорганизмами, плохо воспринимающими краски. Их высокая резистентность во внешней среде , кислотоустойчивость и ряд других свойств связан с особым составом клеточной стенки, большим содержанием липидов и воска.У представителей родов Actinomyces и Nocardia мицелий выражен в значительно большей степени, чем у микобактерий, однако в старых культурах они также проявляют тенденцию фрагментироваться на отдельные клетки неправильной формы. Микроорганизмы рода Actinomyces являются анаэробами, Nocardia - аэробами, многие из которых проявляют кислотоустойчивость. Микроорганизмы, относящиеся к высшим актиномицетам (рода Streptomyces, Micromonospora) образуют мицелий и размножаются наружными неполовыми спорами или конидиями. Обычным местом обитания для большинства из них является почва.

1) Архимицеты – наиболее примитивные, микроскопических размеров; зачаточный мицелий или нет мицелия; тело представляет собой голый комочек протоплазмы, который покрывается оболочкой в процессе превращения в спорангий; размножаются бесполым путем посредством подвижных спор – зооспор, развивающихся в спорангие. Явл. внутриклеточными паразитами низших и высших растений. Z.B. Ольпидиум Olpidium brassicae; Синхитриум Synchytrium endobioticum.

2) Фикомицеты – хорошо развитый одноклеточный, многоядерный мицелий; бесполое размножение происходит при помощи неподвижных спорангиеспор или подвижных зооспор, при половом процессе образуется зигота. Z.B. Фитофтора Phytophthora infenstans; Мукор Mucor; Ризопус Rhizopus/

3) Аскомицеты – сумчатые грибы, мицелий многоклеточный, состоит из многоядерных клеток. Бесполым путем размножаются при помощи конидий; при половом процессе образуются аскоспоры в сумках (асках). Голосумчатые – не образуют плодовые тела Z.B. эндомицес Enlomyces. Плодосумчатые - образуют плодовые тела Z.B. пенициллиум Penicillium; аспергилловые Aspergillus niger, awamori.

4) Базидиомицеты – бесполое размножение редко; основными органами размножения являются базидии с базидиоспорами. а) Одноклеточные базидии: базидии развиваются слоями на плодовых телах Z.B. шляпочные, трутовики, домовые грибы. б) Многоклеточные базидии – большинство не имеет плодовых тел; Z.B. головневые грибы; ржавчинные грибы. Явл. основной массой съедобных грибов р. Boletus, Вешенки, шампиньоны – немикаридные, не нуждаются в симбиозе с высшими растениями, могут выращиваться на экстрактах.

5) Несовершенные грибы – многоклет. грибы, половое размножение не обнаружено; боль-во размножается конидиями, некоторые образуют оидии, другие способны к почкованию или не имеют спец. органов размножения. Z.B. фузариум, ботритис, оидиум и др.

Применение: 1) экологическое (цикл С); 2) отрицательная роль: многие грибы вызывают биоразрушения, выделяя экзоферменты (резина, древесина), 3) биотехнологическое: получение орг. к-т, антибиотиков, сыров, ферментов.

Требования, предъявляемые к питательным средам.

Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах.

1.Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.

2.Оптимальные температура, рН, rH₂, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

1.Психрофилы- растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.

2.Мезофилы- растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум- при 37 градусах С).

3.Термофилы- растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5- 3% агара) и полужидкие (0,3- 0,7 % агара) среды. Агар- полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны- продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты- мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

- универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо- пептонный бульон- МПБ, мясо- пептонный агар- МПА);

- специальные- среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак- Коя на туляремию, среда Левенштейна- Иенсена для возбудителя туберкулеза);

- дифференциально- диагностические- для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам ( среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);

- селективные (элективные)- для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих- пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

Понятие о биохимии.

Целью биотехнологии является получение продуктов из биологических объектов или с их применением, а также воспроизведение биоэффектов, не встречающихся в приро­де. В качестве биологических объектов чаще всего используются одноклеточные микроор­ганизмы, животные и растительные клетки, а также организм животных, человека или растений. Биотехнология использует следующие про­дукты одноклеточных:

а) Сами клетки как источник целевого про­дукта;

б) Крупные молекулы, которые синтезиру­ются клетками в процессе выращивания: фер­менты, токсины, антигены, антитела, пепти-догликаны и др.;

в) Первичные метаболиты — низкомолеку­лярные вещества, необходимые для роста клеток (аминокис­лоты, витамины, нуклеотиды, органические кислоты и др.);

г) Вторичные метаболиты (идиолиты) — низкомолекулярные и макромолекулярные соединения, не требующиеся для роста кле­ток: антибиотики, алкалоиды, токсины, гор­моны и др.

Биотехнология использует эту продукцию клеток как сырье, которое в результате техно­логической обработки превращается в конеч­ный, пригодный для использования, продукт.

Помимо микроорганизмов, животных и растительных клеток биотехнология в качес­тве биологических объектов использует орга­ны и ткани человека и животных, растения, организм животных и человека. Например, для получения инсулина можно использовать

поджелудочную железу крупного рогатого скота и свиней, гормона роста — гипофизы трупов человека; для получения иммуног­лобулинов используют организм лошадей и других животных, препаратов крови — доно­ров и т. д.

Биотехнология играет боль­шую роль в оздоровлении окружающей сре­ды — в экологии, так как с помощью биотех­нологических процессов проводят очистку от загрязняющих веществ почвы, водоемов, воздушную среду путем их биоконверсии и биодеградации.

Значительные, более масштабные и революционные проблемы она решает на пути создания трансгенных животных и рас­тений, т. е. создания новых, ранее неизвес­тных пород животных и растений, а также клонирования животных. Новейший раздел биотехнологии — генетическая и белковая инженерия — позволяет получать совершен­но уникальные биотехнологические эффек­ты, открывать способы диагностики, про­филактики и лечения врожденных болезней, влиять на свойства генома человека, живот­ных и растений.

Следовательно, биотехнология призвана внести существенный вклад в создание эф­фективных диагностических, профилактичес­ких и лечебных медицинских и ветеринарных препаратов, решение продовольственной про­граммы, обеспечение многих технологических процессов в легкой, химической и других от­раслях промышленности, а также в оздоров­лении окружающей среды. В настоящее время в биотехнологии выделяют 4 приоритетных направления: а) медико-фармацевтическое; б) продовольственное; в) сельскохозяйственное; г) экологическое.

Антибиотики

Антибиотики могут быть разделены по происхождению, направленности и спектру действия, по механизму действия.

По происхождению антибиотики могут быть:

- бактериального (полимиксин, грамицидин);

- актиномицетного (стрептомицин, левомицетин, эритромицин);

- грибкового (пенициллин);

- растительного (рафанин, фитонциды);

- животного происхождения (интерфероны, лизоцим).

Больше всего известно антибиотиков актиномицетного происхождения. Актиномицеты- преимущественно почвенные микроорганизмы. В условиях большого количества и разнообразия почвенных микроорганизмов их антогонизм, в том числе с помощью выработки антибиотиков- один из механизмов их выживания.

По спектру действия антибиотики разделяют на:

- действующие преимущественно на грамположительную микрофлору- пенициллин, эритромицин;

- действующие преимущественно на грамотрицательную микрофлору- полимиксин;

- широкого спектра действия ( на грам-плюс и грам-минус флору)- стрептомицин, неомицин;

- противогрибковые- нистатин, амфотеррицин, леварин, низорал;

- противотуберкулезные- стрептомицин, канамицин;

- противоопухолевые- рифампицин;

- противовирусные- интерферон, зовиракс, ацикловир.

Антибиотики разделяют по механизму действия:

- ингибиторы синтеза пептикогликана клеточной стенки ( пенициллин, цефалоспорин, ванкомицин, ристомицин). Действуют на имеющих клеточную стенку растущие бактерии, не действуют на L- формы, покоящиеся формы бактерий;

- ингибиторы синтеза белка (стрептомицин, левомицетин, тетрациклин);

- ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, пуринов и аминокислот (налидиксовая кислота, рифампицин);

- ингибиторы синтеза мембраны и цитоплазматической мембраны грибов (нистатин, полимиксин).

Побочное действие антибиотиков.

Для макроорганизма:

- токсическое действие;

- дисбактериозы;

- аллергические реакции;

- иммунодепрессивное действие;

- эндотоксический шок.

Для микроорганизмов :

- формирование атипичных форм микробов;

- формирование антибиотикорезистентных и антибиотикозависимых форм микроорганизмов.

36. Понятие об инфекции. Условия возникновения инфекционного про­цесса.

Инфекция- совокупность всех биологических явлений и процессов, возникающих в организме при внедрении и размножении в нем микроорганизмов, результат взаимоотношений между макро- и микроорганизмом в виде адаптационных и патологических процессов в организме т.е. инфекционного процесса. Основные этапы инфекционного процесса.

1.Адгезия- прикрепление микроорганизма к соответствующим клеткам хозяина.

2.Колонизация- закрепление микроорганизмов в соответствующем участке.

3.Размножение (увеличение количества- мультипликация).

4.Пенетрация- проникновение в нижележащие слои и распространение инфекта.

5.Повреждение клеток и тканей (связано с размножением, пенетрацией и распространением инфекта).

Инфекционный процесс может быть:

по длительности- острый и хронический.

Динамика развития инфекционной болезни.

Инфекционные заболевания характеризуются цикличностью, сменой периодов.

1.Инкубационный период- от момента заражения до первых клинических признаков (процесс активного размножения возбудителя).

2.Продромальный период (предвестников) характеризуется общими неспецифическими проявлениями- недомоганием, головной болью, повышением температуры и другими симптомами преимущественно токсического генеза.

3.Период развития (разгара) болезни характеризуется типичными (специфическими) для данной инфекции клиническими проявлениями.

4.Период реконвалесценции (выздоровления). В качестве исхода болезни может наступить выздоровление, развиться носительство или летальный исход.

Инфекционное заболевание возникает не при каждом попадании патогенного микроорганизма в организм человека. Требуются определенные условия для реализации:

- достаточная доза микроорганизмов (понятие о критических дозах). Чума- несколько бактериальных клеток, дизентерия- десятки, для некоторых возбудителей- тысячи- сотни тысяч;

- естественный путь проникновения. Существует понятие о входных воротах инфекции, различных для различных групп инфекций- раневых, респираторных, кишечных, урогенитальных с различными механизмами заражения (глаза, кожа, дыхательные пути, желудочно- кишечный тракт, мочеполовая система и др.);

- характеристики возбудителя, его болезнетворные свойства, способность преодолевать защитные механизмы хозяина;

- состояние организма хозяина (наследственность- гетерогенность человеческой популяции по восприимчивости к инфекции, пол, возраст, состояние иммунной, нервной и эндокринной систем, образ жизни, природные и социальные условия жизни человека и др.).

Патогенность (“рождающий болезнь”)- способность микроорганизма вызвать заболевание. Это свойство характеризует видовые генетические особенности микроорганизмов, их генетически детерминированные характеристики, позволяющие преодолеть защитные механизмы хозяина, проявить свои патогенные свойства.

Вирулентность - фенотипическое (индивидуальное) количественное выражение патогенности (патогенного генотипа). Вирулентность может варьировать и может быть определена лабораторными методами (чаще- DL50- 50% летальная доза- количество патогенных микроорганизмов, позволяющая вызвать гибель 50% зараженных животных).

37. Патогенность и вирулентность микроорганизмов. Факторы патогенности.

Основные факторы патогенности микроорганизмов - адгезины, ферменты патогенности, подавляющие фагоцитоз вещества, микробные токсины, в определенных условиях- капсула, подвижность микробов. Вирулентность связана с токсигенностью (способностью образования токсинов) и инвазивностью (способностью проникать в ткани хозяина, размножаться и распространяться). Токсигенность и инвазивность имеют самостоятельный генетический контроль, часто находятся в обратной зависимости (возбудитель с высокой токсигенностью может обладать низкой инвазивностью и наоборот).

Патогенность - т.е. способность микроорганизма вызывать заболевание- более широкое понятие, чем паразитизм. Патогенными свойствами могут обладать не только паразитические виды микробов, но и свободно живущие, в т.ч. возбудители сапронозов (иерсинии, легионеллы и др.). Естественной средой для последних является почва и растительные организмы, однако они способны перестраивать свой метаболизм в организме теплокровных животных и оказывать патогенное действие.

Адгезины и факторы колонизации- чаще поверхностные структуры бактериальной клетки, с помощью которых бактерии распознают рецепторы на мембранах клеток, прикрепляются к ним и колонизируют ткани. Функцию адгезии выполняют пили, белки наружной мембраны, ЛПС, тейхоевые кислоты, гемагглютинины вирусов. Адгезия- пусковой механизм реализации патогенных свойств возбудителей.

Факторы инвазии, проникновения в клетки и ткани хозяина. Микроорганизмы могут размножаться вне клеток, на мембранах клеток, внутри клеток. Бактерии выделяют вещества, способствующие преодолению барьеров хозяина, их проникновению и размножению. У грамотрицательных бактерий это обычно белки наружной мембраны. К этим же факторам относятся ферменты патогенности.

Ферменты патогенности- это факторы агрессии и защиты микроорганизмов. Способность к образованию экзоферментов во многом определяет инвазивность бактерий- возможность проникать через слизистые, соединительнотканные и другие барьеры. К ним относятся различные литические ферменты- гиалуронидаза, коллагеназа, лецитиназа, нейраминидаза, коагулаза, протеазы.

Микрофлора воздуха

С микрофлорой почвы и воды взаимосвяза­на микрофлора воздуха. В воздух также попа­дают микроорганизмы из дыхательных путей и с каплями слюны человека и животных. Здесь обнаруживаются кокковидные и палоч­ковидные бактерии, бациллы, клостридии, актиномицеты, грибы и вирусы. Солнечные лучи и другие факторы способствуют гибе­ли микрофлоры воздуха. Большее количест­во микроорганизмов присутствует в воздухе крупных городов, меньшее — в воздухе сель­ской местности. Особенно мало микроорга­низмов в воздухе над лесами, горами и мо­рями. Много микроорганизмов содержится в воздухе закрытых помещений, микробная обсемененность которых зависит от условий уборки помещения, уровня освещенности, количества людей в помещении, частоты про­ветривания и др.

С целью снижения микробной обсемененности воздуха проводят влажную уборку по­мещения в сочетании с вентиляцией и очис­ткой (фильтрацией) поступающего воздуха. Применяют также аэрозольную дезинфекцию и обработку помещений лампами ультрафи­олетового излучения.

Микробиологический контроль возду­ха проводится с помощью методов естест­венной или принудительной седиментации микробов. Естественная седиментация (по методу Коха) проводится в течение 5—10 мин путем осаждения микробов на поверхность твердой питательной среды в чашке Петри. Принудительная седиментация микробов осуществляется путем «посева» проб воздуха на питательные среды с помощью специаль­ных приборов (импакторов, импинджеров, фильтров). Санитарно-гигиеническое состояние воз­духа определяется по следующим микробио­логическим показателям:

1 Общее количество микроорганизмов в 1 м³ воздуха (так называемое общее микробное число, или обсемененность воздуха) — коли­чество колоний микроорганизмов, выросших при посеве воздуха на питательном агаре в чашке Петри в течение 24 ч при 37 °С, выра­женное в КОЕ;

2 Индекс санитарно-показательных микро­бов — количество золотистого стафилококка и гемолитических стрептококков в 1 м³ воздуха. Эти бактерии являются представителями мик­рофлоры верхних дыхательных путей и имеют общий путь выделения с патогенными микроор­ганизмами, передающимися воздушно-капель­ным путем. Появление в воздухе спорообразу-ющих бактерий — показатель загрязненности воздуха микроорганизмами почвы, а появление грамотрицательных бактерий — показатель воз­можного антисанитарного состояния.

Дня оценки воздуха лечебных учреждений мож­но использовать данные из официально рекомен­дованных нормативных документов.

Раздел 1. Общая микробиология и вирусология.