Реакции с использованием меченых антител или антигенов

Реакция иммунофлюоресценции — РИФ (метод Кунса)

Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с ком­плементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антиге­нов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, ме­ченными флюорохромами, способны светить­ся в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Бактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по пери­ферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в вы­явлении комплекса антиген—антитело с по­мощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабаты­вают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, от­мывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобули­новой (антикроличьей) сывороткой, мечен­ной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Иммуноферментный метод, или анализ (ИФА)

ИФА — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хре­на, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с ме­ченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связав­шихся молекул антигена и антител.

Твердофазный ИФА — наиболее распростра­ненный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реак­ции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках план­шеток из полистирола

При определении антител в лунки планше­ток с сорбированным антигеном последова­тельно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную фер­ментом, и субстрат (хромоген) для фермента.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшие- ся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный но­ситель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят иско­мый антиген, добавляют иммунную сыворот­ку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента.

Конкурентный вариант ИФА. искомый ан­тиген и меченный ферментом антиген кон­курируют друг с другом за связывание ог­раниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест — искомые антитела

и меченые антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены.

ИФА применяют для диагностики вирус­ных, бактериальных и паразитарных болезней в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормо­нов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в ми­норных концентрациях — 10~¹⁰^10~¹² г/л.

Радиоиммунологический метод, или анализ (РИА)

Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген—антитело с примене­нием антигенов или антител, меченных ра­дионуклидом (¹²⁵J, ¹⁴С, ³Н, ⁵¹Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и опре­деляют его радиоактивность в соответствую­щем счетчике (бета- или гамма-излучение):

интенсивность излучения прямо пропорцио­нальна количеству связавшихся молекул ан­тигена и антител.

При твердофазном варианте РИА один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Другой вариант метода — конкурентный РИА. ис­комый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за свя­зывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант исполь­зуют для определения количества антигена в исследуемом материале.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, фермен­тов, лекарственных веществ и иммуноглобу­линов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концент­рациях — 10~^|0-И0~¹² г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг (ИБ) — высокочувстви­тельный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

Антиген выделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг — от англ. blot, пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлоз- ную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами»

антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больно­го + антитело против Ig человека выявляют до­бавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента (рис. 13.12).

ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

2. Из фекалий женщины, контактировавшей с больным холерой, была выделена чистая культура микроорганизмов, морфологически подобных холерному вибриону. Дальнейшее исследование было решено не проводить. Достаточно ли фактов для постановки диагноза? С помощью каких исследований можно отдифференцировать возбудителя холеры от холероподобных вибрионов?

Ответ: При подозрении на холеру применяют ускоренные методы бактериологической диагностики: люминесцентно-серологический. иммобилизации вибрионов холерной 0- сывороткой с последующей микроскопией в тёмном поле и др. Анализ занимает от 15 мин до 2 ч. К методам экспресс-диагностики также можно отнести выявление антигенов холерных вибрионов в исследуемом материале в РКА. PJ1A. ИФА. ГЩР. Результаты всех перечисленных методов расценивают как ориентировочные. Бактерии, не агглютинируемые противохолерной О-сывороткой, называют НАГ-вибрионами. Они могут вызывать сходные с холерой заболевания. Кроме стабильного эндотоксина, выделяющегося при разрушении микроорганизма. НАГ-вибрионы образуют термолабильный эндотоксин и способны вызывать холероподобные заболевания.

1. Состав и применение вакцины клещевого энцефалита инактивированной

Состав. Вакцина содержит стерильную взвесь инактивированного формалином вируса клещевого энцефалита, полученного путем репродукции его во взвеси клеток эмбрионов курицы, сорбированного на гидроокиси алюминия. Должна иметь цвет от розово-красного до красного.Выпускается в жидкой форме в 2 мл ампулах, доза — 1 мл.Назначение — для активной профилактики в выработки иммунитета к вирусу клещевого энцефалита, а также для вакцинации доноров с целью получения специфического иммуноглобулина и иммунной плазмы для профилактики и лечения клещевого энцефалита.Способ введения и дозировка. Первичный курс вакцинации состоит из трех инъекций препарата. Первые две проводят н ноябре—декабре, вторую — через 14—30 сут после верной, третью — через 3 мес после второй (март — апрель), не позднее чем за 14 сут до посещения очага инфекции.Для экстренной профилактики проводится двукратная вакцинация с интервалом от 30 до 60 сут. Последняя прививка должна быть проведена не позднее чем за 14 сут до выхода в очаг инфекции.Ежегодно необходимо проводить на протяжении 3 лет однократную ревакцинацию, но не позже 14 суток до выхода в очаг. Если пропущены одна из ежегодных ревакцинаций, допускается продолжение прививок, по выше указанной схеме, если пропущены две ревакцинации, курс прививок проводят заново. Доза препарата для детей 4-6 лет – 0,5 мл на инъекцию, для детей старше 6 лет и взрослых – 1 мл. Вакцину вводят подкожно у нижнего угла лопатки.Прививочные реакции. Вакцина вызывает кратковременное ощущение жжения, иногда отмечаются местные реакции в виде покраснения, болезненности, инфильтрата в месте введения. Продолжительность не превышает 5 суток. Общие реакции продолжаются не более 3 суток и выражаются в повышении температуры, головной боли, недомогания. Противопоказания – острые инфекционные и неинфекционные заболевания, туберкулез и ревматизм в активной форме, наследственные, дегенеративные о прогрессирующие заболевания нервной системы, эпилепсия, аллергические реакции, хронические заболевания печени и почек, сердечно-сосудистая недостаточность 2 и 3 степени, перенесенные инфаркт миокарда и инсульт, диабет и др эндокринные нарушения, злокачественные новообразования, болезнь крови, беременность.

Экзаменационный билет №22