Размножение бактерий на жидких и плотных питательных средах. фазы развития бактериальной популяции

• Размножение бактерий определяется временем генерации, т. е. периодом, в течение которого осуществляется деление клетки.

• Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, популяции, состава питательной среды, температуры и других факторов.

• В оптимальных условиях время генерации у разных бактерий колеблется довольно в широких пределах: от 20 мин у кишечной палочки до 14 ч у микобактерий туберкулеза, в связи с чем, их колонии образуются через 18—20 ч, либо через 3—5 нед. соответственно.

Особенности микробного роста на жидких питательных средах

• Рост бактерий с равномерным помутнением среды.

• Придонный рост бактерий, характеризующийся образованием осадка на дне пробирки с жидкой питательной средой.

• Пристеночный рост бактерий, выражающийся в образовании рыхлых хлопьев, прикрепленных к внутренней поверхности стенок сосуда.

• Поверхностный рост бактерий, характеризующийся появлением на поверхности жидкой питательной среды пленки.

Факторы роста бактерий:

• аминокислоты,

• пуриновые и пиримидиновые основания,

• липиды,

• витамины,

• железопорфирины (гем)

• и другие соединения.

Метод получения чистых культур м/о

• Чистой культуройназывают такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий - обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами.

• Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.

• Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.

Методы выделения чистых культур м/о

• Посев однократным истощающим штрихом

• Посев истощающим штрихом секторами

• Посев на скошенный агар, метод Шукевича

o Посев на скошенный агар применяют для накопления и хранения чистой культуры бактерий

o Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара . Подвижные микроорганизмы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару , неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.

· Посев уколом

· Метод Дригальского

0,1мл материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

· Метод Коха (метод серийных разведений)

последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме.

· Метод мембранных фильтров

Этапы выделения чистой культуры микроорганизмов

I этап (нативный материал)

• Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре).

• Посев на плотные питательные среды (получение колоний).

II этап (изолированные колонии)

• Изучение колоний (культуральные свойства бактерий).

• Микроскопическое изучение микробов в окрашенном мазке

(морфологические свойства бактерий).

• Посев на скошенный питательный агар для выделения чистой культуры.

III этап (чистая культура)

• Определение культуральных, морфологических, биохимических

и других свойств для идентификации культуры бактерий

Выделение чистой культуры

Культуральные свойства:Характеристика колоний микроорганизма

Морфологическое и структурное разнообразие колоний:

1 — формы выпуклости колоний над поверхностью питательной среды; 2 — очертания колоний; 3 — характер края колоний; 4 — внутренняя структура колоний.

Форма колоний:

а – круглая; б – круглая с фестончатым краем;
в – круглая с валиком по краю; г; д – ризоидная; е – с ризоидным краем;
ж –амебовидная; з – нитевидная; и – складчатая; к – неправильная;
л – концентрическая; м – сложная

Профиль колоний:а – изогнутый; б – кратерообразный; в – бугристый; г – врастающий в агар; д – плоский; е –выпуклый;ж – каплевидный; з - конусовидный

Край колоний:а - гладкий; б – волнистый; в – зубчатый;г – лопастный; д – неправильный; е – реснитчатый;ж – нитчатый; з – ворсинчатый; и - ветвистый

R- и S- типы колоний м/о

Своеобразной формой изменчивости является R-S-диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип - R-колонии (англ. rough - неровный) - характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип - S-колоний (англ. smooth- гладкий)- имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т.е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме, иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже. Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые растут в R-форме.

В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды.

Мутации, которые приводят к S-R-диссоциации, относятся к инсертационным, поскольку они возникают после встраивания внехро-мосомных факторов наследственности, в том числе и умеренных фагов в бактериальную хромосому. Если эта мутация приводит к утрате генов, контролирующих образование детерминантных полисаха-ридных звеньев ЛПС у грамотрицательных бактерий, то образуются R-мутанты. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией соответствующими бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин. У других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is-последовательностей. R-формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате рекомбинаций.

Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке.

Вместе с тем S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например дизентерии Зонне, эшерихиоза, вызванного Е. coli О124 и др.