Б. Количественное определение общего белка в моче с помощью сульфосалициловой кислоты
Для работы необходимы: фотоэлектроколориметр (ФЭК), центрифужные мерные пробирки, 3% раствор сульфосалициловой кислоты, мерная пипетка.
Ход работы. 1. В центрифужную пробирку налить 1,25·10-3 л (1,25 мл) профильтрованной мочи. Долить до 5·10-3 л (5 мл) 3% раствор сульфосалициловой кислоты.
2. Через 15 мин на ФЭКе против контроля определить оптическую плотность. При этом использовать оранжевый светофильтр № 7 (длина волны 650-590 нм), кювету с рабочей шириной 5·10-3 м (5 мм).
3. Постановка контроля: в центрифужную пробирку наливают 1,25·10-3 л (1,25 мл) профильтрованной мочи и доливают до 5·10-3 л (5 мл) 0,9% раствором хлорида натрия. Производят измерения на ФЭКе при тех же условиях, что и в опытной пробе. При расчете из оптической плотности опыта вычитают оптическую плотность контроля.
4. Расчет произвести по калибровочному графику. Для его построения необходимо приготовить стандартные растворы альбумина в 0,9% растворе хлорида натрия с концентрацией белка (5, 10, 20, 50 и 100)·10-2 г/л (5, 10, 20, 50 и 100 мг%). Из каждого разведения взять по 1,25·10-3 л (1,25 мл) и обработать так же, как опытные пробы. Прямолинейная зависимость при построении калибровочного графика сохраняется до концентрации 100·10-2 г/л (100 мг%)*.
* (Расчет по калибровочной кривой см. "Унифицированные методы клинических лабораторных исследований" / Под ред. В. В. Меньшикова, М., Издательство I ММИ, 1971, в. III, ч. I.)
Задание 4. Определение сахара в моче
А. Качественная проба Гайнеса
Для работы необходимы: пробирки, градуированные пипетки, водяная баня, реактив для определения сахара в моче*.
* (Приготовление реактива: 1) 13,3·10-3 кг (13,3 г) химически чистого кристаллического сульфата меди (CuSО4·5H2О) растворить в 400·10-3 л (400 мл) воды; 2) 50·10-3 кг (50 г) едкого натра растворить в 400·10-3 л (400 мл) воды; 3) 15·10-3 кг (15 г) чистого глицерина развести в 200·10-3 л (200 мл) воды; 4) смешать первый и второй растворы и тотчас прилить третий. Реактив стоек.)
Ход работы. 1. К 4·10-3 л (4 мл) реактива прибавить 8-12 капель мочи и поставить в кипящую водяную баню. В присутствии сахара жидкость окрашивается в желтый или красный цвет, появляется осадок. При отсутствии сахара в моче цвет реактива не меняется (синий).
Б. Определение сахара в моче
Для работы необходимы: реактивная бумага "Глюкотест".
Ход работы. 1. На реактивную бумагу нанести несколько капель мочи. В присутствии сахара в моче изменяется окраска бумаги.
2. Моча для исследования должна быть свежей, так как при стоянии ее на холоду количество сахара в моче значительно уменьшается, а если его немного, то совсем исчезает.
Нервно-мышечная система
Методы исследования свойств мышц. Физиологические свойства мышечной ткани обычно изучают на нервно-мышечном препарате лягушки, чаще всего на изолированной икроножной мышце с седалищным нервом. Нервно-мышечный препарат помещают в специальную камеру, в которой поддерживают определенную влажность.
В качестве раздражителя преимущественно используют электрический ток. Однако можно применять механические (щипок, укол, удар), химические (кислоты), температурные (тепло, холод) и другие раздражители.
О функциональном состоянии мышцы судят по результатам регистрации ее Механической реакции (миография) и биопотенциалов (электромиография).
Регистрация мышечного сокращения. Для записи сокращений мышцы ее укрепляют в вертикальном миографе, специальном зажиме, в который помещают бедренную кость нервно-мышечного препарата. Сухожилие мышцы соединяют с пишущим рычажком, свободный конец которого прикладывают к барабану кимографа. Главную часть кимографа - барабан - покрывают бумагой. Барабан приводят в равномерное вращение часовым механизмом или электромотором. Часовой механизм заводят с помощью ключа. Для приведения барабана во вращение смещают стопор, находящийся на стенке коробки часового механизма. Скорость вращения регулируют с помощью специального валика, расположенного на оси барабана. Для замедления вращения применяют крылатки, оказывающие сопротивление действию часового механизма.
Для электрического раздражения мышцы используют электронные стимуляторы или санный аппарат Дюбуа-Реймона.
Основной частью стимулятора является генератор колебаний, включающий электронные лампы или транзисторы. Прибор питается от сети переменного тока и имеет гнезда для подключения электродов. На лицевой панели стимулятора имеются ручки и шкалы. Поворотом тумблера "частота" устанавливают нужную частоту раздражения в секунду, переключателем "длительность" устанавливают необходимую продолжительность стимуляции. С помощью ручки "амплитуда" и тумблера переключения диапазонов амплитуды (×1, ×10) можно изменять величину раздражающего стимула. Имеется тумблер "пуск", при включении которого раздражение подается к препарату. Корпус заземляют.
При раздражении нервно-мышечного препарата возникает мышечное сокращение, которое регистрируется на барабане кимографа в виде кривой, получившей название миограммы.
Задание 1. Приготовление нервно-мышечного препарата лягушки
Для работы необходимы: набор препаровальных инструментов (ножницы большие и малые, пинцет хирургический и глазной, металлический зонд для разрушения спинного мозга, два стеклянных крючка), изоосмотический раствор хлорида натрия для холоднокровных.
Ход работы. 1. Лягушку завернуть в марлевую салфетку, одну браншу ножниц ввести в полость рта, вторую поместить за глазами и, сомкнув их, удалить головной мозг. Зондом разрушить спинной мозг. Острием ножниц проткнуть полость тела, ввести в нее браншу ножниц и, отступя на 1·10-2 м (1 см) от копчиковой кости, перерезать позвоночник.
2. Держа лягушку за задние лапки и опустив ее головой вниз, отрезать всю свисающую половину туловища и внутренности.
3. Захватить одной рукой остаток позвоночника, другой - край кожи со спины, быстрым движением снять кожу с обеих лапок (в этом случае получают препарат двух задних лапок лягушки).
4. Фиксировать препарат двух лапок так, чтобы они висели вниз под прямым углом к позвоночнику, ножницами осторожно вырезать копчиковую часть. Затем продольно по средней линии отделить лапки друг от друга.
5. Подведя под ахиллово сухожилие браншу ножниц, отделить его по всей длине и, захватив сухожилие пинцетом, оттянуть мышцу в сторону и разорвать фасции, связывающие ее с другими тканями.
6. Для выделения нерва бедро расположить задней поверхностью кверху. Мышцы развести и отпрепарировать двумя стеклянными крючками нерв по всей его длине.
7. Перерезать бедренную кость выше коленного сустава, а кости голени ниже него. Полученный нервно-мышечный препарат поместить в изоосмотический раствор хлорида натрия для холоднокровных.
Задание 2. Изучение физиологических свойств нервов и мышц
Для работы необходимы: электронный стимулятор (или санный аппарат Дюбуа-Реймона), электроды, набор препаровальных инструментов, миограф, кимограф, гальванический пинцет, изоосмотический раствор хлорида натрия для холоднокровных.
Ход работы. 1. Приготовить нервно-мышечный препарат лягушки и фиксировать его в миографе.
2. Соединить сухожилие мышцы с пишущим рычажком.
3. Зарядить пишущий рычажок чернилами.
4. Записать мышечные сокращения при раздражении мышцы непосредственно - прямое раздражение и через нерв - непрямое раздражение: а) гальваническим пинцетом; б) электрическим током; в) щипком.
5. Начиная с минимальной (подпороговое раздражение), изменять силу тока и получить минимальное и максимальное сокращение мышцы.
6. Записать сокращение мышцы при минимальной скорости вращения барабана кимографа.
Задание 3. Регистрация одиночного сокращения изолированной мышцы, зубчатого и гладкого тетануса
Для работы необходимы: электронный стимулятор (санный аппарат Дюбуа-Реймона), электроды, миограф, кимограф, универсальный штатив, писчики, влажная камера, набор препаровальных инструментов, изоосмотический раствор хлорида натрия для холоднокровных.
Ход работы. 1. Приготовить нервно-мышечный препарат лягушки, укрепить его в миографе, соединить с писчиком. Подвести электроды вплотную к мышце.
2. При частоте раздражения 1 Гц (одиночное раздражение) определить пороговую силу раздражения и несколько увеличить ее.
3. Записать на барабане кимографа миограммы при нанесении на мышцу раздражения: а) 1 Гц; б) 5-10 Гц; в) 20-40 Гц.
Задание 4. Зависимость работы изолированной мышцы от нагрузки. Определение мышечной силы
Для работы необходимы: электронный стимулятор (катушка Дюбуа-Реймона), влажная камера с электродами, миограф с подпоркой, набор грузов с крючками, набор препаровальных инструментов, изоосмотический раствор хлорида натрия для холоднокровных.
Ход работы. 1. Приготовить нервно-мышечный препарат лягушки.
2. Изолировать икроножную мышцу.
3. Ахиллово сухожилие соединить с рычагом миографа прочной ниткой или проволокой. Под рычаг поставить особую подпорку, которая будет препятствовать растягиванию мышцы при подвешивании груза и позволит лишь поднимать груз при сокращении.
4. Подобрать силу и частоту раздражений, дающих наиболее высокое тетаническое сокращение. Запись вести на неподвижном барабане кимографа.
5. Записать максимальную высоту сокращения мышцы, без нагрузки.
6. К рычагу (к той же точке, за которую тянет мышца) подвесить груз в 2,5·10-2-3·10-2 кг (25-30 г) и снова записать высоту сокращения в ответ на раздражение. Под графиком отметить массу груза.
7. Не меняя силу и частоту раздражения, при постепенном увеличении нагрузки на 5·10-3 кг (5 г) и одновременной регистрации высоты сокращения найти предельный груз, который мышца может поднять. Эта величина, выраженная в килограммах, и будет соответствовать абсолютной силе мышцы.
8. Вычислить работу мышцы при различных нагрузках по формуле:
A=m·h,
где А - работа; m - масса груза; h - высота сокращения.
Задание 5. Эргография
Для работы необходимы: эргограф, кимограф, метроном, набор грузов (1-3 кг), циркуль, линейка.
Ход работы. 1. Укрепить предплечье в станке эргографа.
2. Надеть кожаное кольцо, соединенное с грузом и пишущим устройством, на указательный палец. Остальными пальцами для исключения их движения охватить вертикальный стержень.
3. Подвесить на шнур груз массой 2 кг и включить метроном с частотой 60 ударов в 60 с (1 мин).
4. Обследуемый начинает поднимать груз в заданном ритме до полного утомления.
5. Отметить время начала и окончания работы и определить ее продолжительность.
6. По эргограмме определить величину работы, выполненной сгибателем пальца. Для этого определить высоту каждого подъема кривой, полученные величины сложить и умножить на массу груза.
7. После отдыха повторить исследование с грузом массой 3 кг и частотой совершаемых движений 120 в 60 с (1 мин).
Задание 6. Измерение силы мышц человека при помощи кистевого динамометра (динамометрия)
Для работы необходим: кистевой динамометр.
Ход работы. 1. Определить мышечную силу сгибателей пальцев правой и левой руки с помощью кистевого динамометра.
2. Определить силу обеих рук на растяжение.
3. Определить силу разгибателей пальцев после многократных сжатий пружины динамометра.
Центральная нервная система
Задание 1. Определение времени двигательного рефлекса по Тюрку у спинальной лягушки в зависимости от силы раздражения
Для работы необходимы: штатив с крючком, набор препаровальных инструментов (большие и маленькие ножницы, пинцеты, зонд), стаканчики с 0,5% и 0,1% растворами серной кислоты, стакан с водой для обмывания лягушки, секундомер.
Ход работы. 1. Приготовить спинальную лягушку. С этой целью у лягушки удалить головной мозг (декапитация), оставляя неповрежденным спинной. Полученный спинномозговой препарат укрепить на крючке штатива. Тотчас после удаления головного мозга опыты производить нельзя, так как животное находится в состоянии шока, сопровождающегося угнетением активности спинного мозга.
2. Через 2-3 мин погрузить одну из задних лапок в 0,1% раствор серной кислоты. Определить время от момента погружения лапки до ответной реакции.
3. Обмыть лапку водой. Повторить опыт с раствором серной кислоты большей концентрации (0,5%).
Задание 2. Анализ рефлекторной дуги
Для работы необходимы: штатив, набор препаровальных инструментов, 0,5% раствор серной кислоты, фильтровальная бумага, стакан с водой.
Ход работы. 1. Приготовить спинномозговой препарат лягушки и укрепить его на крючке штатива.
2. Отпрепарировать на задней поверхности бедра одной из лапок седалищный нерв и подвести под него лигатуру, не завязывая ее.
3. Положить на голень другой лапки кусочек фильтровальной бумаги, смоченной 0,5% раствором серной кислоты. Отметить наличие сгибательного рефлекса.
4. Обмыть лягушку водой. Удалить с голени той же лапки часть кожи и приложить к обнаженной мышце кусочек фильтровальной бумаги, смоченной кислотой. Убедиться в отсутствии рефлекторной реакции.
5. Обмыть лягушку, на лапке с отпрепарированным седалищным нервом произвести раздражение кожи фильтровальной бумагой, смоченной кислотой. Обратить внимание на ответную реакцию.
6. Обмыть лягушку водой, перерезать седалищный нерв и повторить раздражение кожи этой лапки. Сравнить реакцию с реакцией, отмеченной в предыдущем опыте.
7. Аналогичным путем раздражать кожу передней лапки лягушки. Отметить наблюдаемую реакцию.
8. Обмыть лягушку водой, разрушить спинной мозг, введя зонд в спинномозговой канал. Повторить опыт с раздражением передней лапки. Объяснить причину отсутствия двигательной реакции.
Задание 3. Торможение рефлексов спинного мозга (опыт И. М. Сеченова)
Для работы необходимы: штатив с крючком, стакан с 0,25% раствором серной кислоты, стакан с водой, кристаллический хлорид натрия, набор препаровальных инструментов, вата, изоосмотический раствор для холоднокровных (0,65% раствор хлорида натрия), секундомер.
Ход работы. 1. У лягушки удалить головной мозг до уровня зрительных бугров (произвести декапитацию вблизи от глаз).
2. Подвесить препарат лягушки на крючок штатива за нижнюю челюсть. Определить время сгибательного рефлекса задней конечности лягушки по Тюрку (два раза с интервалом в 2-3 мин).
3. Тщательно осушить ватным тампоном поверхность мозгового разреза. Обнажить зрительные бугры. Для этого маленькими ножницами вырезать небольшой кожный лоскут над оставшейся частью черепной коробки, под ним удалить более темную часть костной покрышки. С этой целью бранши ножниц вводят по бокам начальных участков спинномозгового канала, делают два продольных надреза, большим пинцетом приподнимают костный участок и срезают его ножницами. На обнаженные зрительные бугры помещают кристаллик хлорида натрия.
4. Через 1-2 мин повторяют определение времени рефлекса. Убедиться, что время рефлекса резко увеличилось.
5. Удалить кристалик хлорида натрия, обмыть область зрительных бугров изоосмотическим раствором. Через 5 мин вновь определить время рефлекса. Оно должно вернуться к исходной величине.
Задание 4. Виды безусловных рефлексов
Для работы необходимы: учебный электростимулятор, набор препаровальных инструментов, 0,5% раствор серной кислоты, фильтровальная бумага, нарезанная квадратиками, 1% раствор новокаина, стакан с водой, перкуссионный молоточек, препаровальная дощечка, марлевые лямки для фиксации лягушки.
Ход работы. Экстероцептивные рефлексы с кожи. 1. Приготовить спинальную лягушку и укрепить ее на крючке штатива. По прекращении шока произвести раздражение пинцетом:
а) тыльной стороны пальцев лапки;
б) подошвенной стороны лапки.
2. Положить фильтровальную бумажку, смоченную 0,5% раствором серной кислоты:
а) на брюшке между передними лапками;
б) обмыв лягушку водой, на заднюю поверхность бедра.
В каждом случае в результатах отметить характер ответной реакции.
Интероцептивные рефлексы. Висцеро-висцеральные рефлексы (рефлексы с одного внутреннего органа на другой). 1. Спинальную лягушку укрепить на препаровальной дощечке, вскрыть полость тела, обнажить сердце и кишечник. Сосчитать количество сердечных сокращений в 1 мин.
2. Произвести поколачивание кишечника ручкой пинцета. Обратить внимание на изменение деятельности сердца. Снова сосчитать количество сердечных сокращений в 1 мин.
Объяснить полученные результаты и нарисовать схему рефлекторной дуги.
Висцеромышечные рефлексы (рефлексы с внутренних органов на скелетную мускулатуру). 1. У той же лягушки раздражать петлю кишки электрическим током пороговой силы (используя учебный электростимулятор) или механически (пинцетом). Наблюдать двигательную реакцию лягушки.
2. Смазать кишечную петлю раствором новокаина и через 5 мин снова произвести ее раздражение. Обратить внимание на отсутствие двигательной реакции лягушки. Объяснить полученные результаты.
Проприоцептивные (сухожильные) рефлексы человека. 1. Коленный рефлекс. Обследуемому предлагают сесть на стул и положить ногу на ногу. Произвести легкий удар ребром ладони руки или перкуссионным молоточком по сухожилию четырехглавой мышцы ниже коленной чашечки. Наблюдать разгибание голени.
2. Ахиллов рефлекс. Обследуемый становится коленями на стул. Ступни ног должны свободно свисать. Произвести легкий удар ребром ладони руки или перкуссионным молоточком по ахиллову сухожилию. Наблюдать подошвенное сгибание стопы.
Высшая нервная деятельность
Задание 1. Образование двигательных условных рефлексов у мелких животных (мыши, крысы)
Для работы необходимы: камера условных рефлексов для мелких животных, реостат на 80 или 100 Ом, ключ-рубильник, провода, условные раздражители (электрические лампочки красного и синего цвета).
Описание камеры условных рефлексов для мелких животных. Камера условных рефлексов для мелких животных представляет собой деревянный ящик размером 0,6×0,35×0,3 м (60×35×30 см). Сверху камера покрыта металлической сеткой. Продольной перегородкой камера разделена на две равные части. В перегородке имеется отверстие, через которое животное может переходить из одной половины камеры в другую. В задней стенке камеры имеется дверца для впуска животных в камеру. Дно обеих половин камеры представляет собой ряд алюминиевых пластинок, соединенных последовательно через реостат с источником электрического тока. Алюминиевые пластинки по концам и в середине прикреплены к деревянному полу камеры. Промежутки между пластинками 3·10-3 м (3 мм).
Ход работы. 1. Крысу помещают в одно из отделений камеры. При помощи реостата и ключа-рубильника подбирают такую силу тока, чтобы животное перебегало из половины камеры, находящейся под током, в другую половину, где тока нет. После этого приступают к выработке двигательно-оборонительного условного рефлекса. В качестве условного сигнала используют красный свет.
2. В той половине камеры, где находится крыса, зажигают красную лампочку и через 2-3 с после условного раздражителя включают электрический ток - животное перебегает в другое отделение камеры.
3. Через 30-60 с повторяют опыт. После 15-20 сочетаний (иногда больше) у животных вырабатывается условный рефлекс: крыса перебегает в противоположное отделение камеры при действии одного только условного сигнала (включение красной лампочки).
4. После образования условного рефлекса приступают к выработке дифференцировочного торможения. Для этой цели включают синюю лампочку, никогда не подкрепляя ее безусловным раздражителем - электрическим током. Вначале на синюю лампочку также будет проявляться условнорефлекторная реакция - крыса будет перебегать в другое отделение камеры.
5. Зажигать попеременно то красный, то синий свет, подкрепляя только первый включением электрического тока.
6. После нескольких таких сочетаний на зажигание красной лампочки животное будет перебегать в другое отделение камеры, а при действии дифференцировочного раздражителя (синий свет) крыса должна оставаться на месте.
7. После выработки дифференцировочного торможения производят угашение условного рефлекса: включают только красный свет, не подкрепляя его электрическим током. Через некоторое время условнорефлекторная реакция угасает (животное перестает реагировать на включение красного света).