Основы классификации и морфологии микроорганизмов
Морфологический период развития микробиологии (XVII—XVIII вв.) не дал возможности классифицировать микроорганизмы, так как царил описательный период, т. е. морфологический. В течение XIX столетия был накоплен большой материал о различных свойствах микроорганизмов, постепенно увеличивался список видов микробов, и возникла необходимость систематики и их номенклатуры. И лишь в 1923 г. американский ученый Д. Берги выпустил первый международный определитель бактерий, который впоследствии дополнялся и изменялся.
С 1 января 1980 г. для микроорганизмов принята Единая международная классификация, в основе которой лежит система Берги.
Основными ступенями всех классификаций являются: царство — класс — порядок — семейство — род — вид. Главной классификационной категорией является вид — совокупность организмов, имеющих общее происхождение, сходные морфологические, физиологические признаки и обмен веществ.
Мир микроорганизмов делится на 2 группы: эукариоты и прокариоты. Бактерии относятся к царству прокариотов, представители которых, в отличие от эукариотов, не обладают оформленным ядром. Наследственная информация у прокариотов заключена в молекуле ДНК, располагающейся в цитоплазме клетки.
Внутри вида существуют варианты: морфоварианты, или морфовары, отличающиеся по морфологии; биовары — по биологическим свойствам, хемовары — по ферментативной активности, серовары — по антигенной структуре, фагова-ры — по чувствительности к фагам.
Для обозначения микроорганизмов принята общебиологическая бинарная (двойная) номенклатура. Первое название обозначает род и пишется с прописной буквы. Второе название обозначает вид и пишется со строчной буквы. Например, Staphylococcus aureus — стафилококк золотистый, S. aureus.
Медицинская микробиология, главным образом, изучает патогенные бактерии, вирусы, простейшие, спирохеты, микоплазмы, риккетсии, хламидии. Большинство микробов представляют собой невидимые невооруженным глазом одноклеточные (бактерии, актиномицеты, спирохеты, простейшие), неклеточные (вирусы), а также многоклеточные организмы (сине-зеленые водоросли, некоторые грибы, хлами-добактерии).
Бактерии (от лат. bacteria — палочка) — это одноклеточные организмы, лишенные хлорофилла. По биологическим свойствам — прокариоты. Размеры от 0,1 до 0,15 микрометра до 16—28 мкм. Размеры и форма бактерий непостоянны и меняются от влияния среды обитания.
По внешнему виду бактерии делятся на 4 формы: шаровидные (кокки), палочковидные (бактерии, бациллы и клос-тридии), извитые (вибрионы, спириллы, спирохеты) и нитевидные (хламидобактерии).
1. Кокки (от лат. coccus — зерно) — шарообразный микроорганизм, бывает сферической, эллипсовидной, бобовидной и ланцетовидной формы. По расположению, характеру деления и биологическим свойствам кокки подразделяются на микрококки, диплококки, стрептококки, тетракокки, сар-цины, стафилококки.
Микрококки характеризуются одиночным, парным или беспорядочным расположением клеток. Они являются сап-рофитами, обитателями воды, воздуха.
Диплококки (от лат. diplodocus — двойной) делятся в одной плоскости и образуют кокки, соединенные по две особи. К диплококкам относятся менингококки — возбудители эпидемического менингита и гонококки — возбудители гонореи и бленнореи.
Стрептококки (от лат. streptococcus — витой), делящиеся в одной плоскости, располагаются цепочками различной длины. Имеются патогенные для человека стрептококки, вызывающие различные заболевания.
Тетракокки (от лат. tetra— четыре), располагающиеся по 4, делятся в двух взаимноперпендикулярных плоскостях.
Редко встречаются в качестве возбудителей болезней у человека.
Сардины (от лат. saris — связываю) — кокковые формы, которые делятся в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и выглядят в виде тюков по 8—16 и более клеток. Часто встречаются в воздухе. Болезнетворных форм нет.
Стафилококки (от лат. staphylococcus) — гроздевидно расположенные кокки, делящиеся в различных плоскостях; располагаются неправильными скоплениями.
Некоторые виды вызывают у человека и животных заболевания.
2. Палочковидные формы подразделяются на бактерии, бациллы и клостридии.
Средние размеры от 1 до 6 мкм в длину и 0,5—2 мкм в ширину.
К бактериям относятся палочковидные микроорганизмы, как правило, не образующие спор (кишечная палочка, брюшнотифозная, паратифозные, дизентерийные, дифтерийные, туберкулезные и др.).
К бациллам (от лат. bacillus — палочка) и клостридиям (от лат. closter — веретено) принадлежат микробы, в большинстве своем образующие споры (сенная, сибиреязвенная, столбнячная, возбудители анаэробной инфекции).
По форме палочковидные бактерии бывают короткими (туляремийная), длинными (сибиреязвенная) с закругленными и заостренными концами.
По взаимному расположению палочковидные формы распределяются на три подгруппы:
— диплобактерии и диплобациллы, располагающиеся попарно по длине (бактерии пневмонии);
— стрептобактерии (возбудитель мягкого шанкра) и стреп-тобациллы (бациллы сибирской язвы);
— бактерии и бациллы, которые располагаются без определенной системы (большинство палочковидных форм).
Встречаются бактерии с булавовидными утолщениями на концах — возбудитель дифтерии, некоторые имеют ветвления — микробактерии туберкулеза и лепры. Общее число палочковидных форм бактерий больше, чем корковидных.
3. К извитым формам бактерий относятся вибрионы, спириллы и спирохеты.
Вибрионы (от лат. vibrio — изгибаюсь — клетки, изгиб которых равен 14 завитка спирали, имеющие вид запятой). Типичный представитель — холерный вибрион и водные вибрионы.
Спириллы (от лат. spira — изгиб) — имеют изгибы с одним или несколькими оборотами спирали. Из патогенных известен один вид spirillum minor — возбудитель содоку, способный вызывать у человека болезнь, передающуюся через укус крыс и других грызунов.
Спирохеты (от лат. spirochaeta — бактерия в виде изогнутого длинного винта — штопорообразная форма. Размеры от 0,3—1,5 мкм в ширину и 7—500 мкм в длину). В семейство входят сапрофиты и патогенные виды. Они обитают в загрязненных водоемах, на мертвых субстратах. К патогенным относятся три рода: Treponema, Leptospira, Borrelia.
Все микробы обладают полиморфизмом, т. е. индивидуальной изменчивостью форм под влиянием различных факторов — температуры, питательной среды, концентрации солей, кислотности, продуктов метаболизма, дезинфицирующих агентов, лекарственных препаратов.
Способность микробов изменяться учитывается в лабораторной диагностике инфекционных болезней, при изготовлении биологических препаратов, применяемых для профилактических и лечебных целей.
Ультраструктура бактерии
Бактерии (прокариоты) существенно отличаются от клеток растений и животных (эукариоты). ^
Прокариоты — обычно содержат один ген, который не отделен специальной мембраной от цитоплазмы, не имеют митохондрий и аппарата Гольджи, не обладают амебоидным движением. Они состоят из нуклеоида, цитоплазмы (содержащей различные включения), оболочки и других структур-органоидов (жгутики), и несмотря на внешнюю простоту строения бактериальной клетки, представлют собой сложное живое существо.
Ультраструктура бактерий изучается с помощью электронно-микроскопических и микрохимических исследований.
* Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат, состоит из двойной нити ДНК, сомкнутой в кольцо и свободно погруженное в цитоплазму, в отличие от эукариотов. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки.
* Цитоплазма бактерий — дисперсная смесь коллоидов, состоящая из воды, белков, углеводов, липидов, минеральных соединений и других веществ. Бактериальная цитоплазма неподвижна, имеет высокую плотность, содержит мелкие зерна, состоящие из 60% РНК и 40% протеина, представляющие собой рибонуклеоп-ротеиды, получившие название «рибосом». Они выполняют функцию синтеза белка.
В цитоплазме находятся включения: гранулы, содержащие запасные питательные вещества; гранулы волютина, ли-попротеидные тельца, гликоген, пигментные скопления, сера, кальций и др. Гранулы волютина окрашиваются более интенсивно, чем цитоплазма клетки, и содержат метафос-фаты. Они обнаруживаются в некоторых видах бактерий, как, например: Corynebacterium diphtheriae, что учитывается при лабораторной диагностике дифтерии. Липопротеидные тельца в виде капель жира довольно часто встречаются у ряда бацилл и спирилл. Они исчезают при голодании клеток и появляются при росте бактерий на питательных средах, содержащих много углеводов.
Биологическое значение гранул волютина и липопротеиновых включений состоит в том, что они служат запасным питательным материалом и используются бактериями при недостатке питательных веществ.
Роль вакуолей изучена недостаточно. Одни ученые их рассматривают как участки, где откладываются вредные продукты метаболизма (экзотоксины), другие приписывают им роль добавочных ферментов дыхания.
Оболочка бактерий состоит из цитоплазматической мембраны, клеточной стенки и капсульного слоя, превращающегося у некоторых видов в истинную капсулу.
Цитоплазматическая мембрана прилегает к внутренней поверхности стенки и состоит из трех слоев: липидного, протеинового и полисахаридного. Она выполняет функцию разделительной перегородки, через нее с помощью ферментов осуществляется активный транспорт различных веществ и ионов, необходимых для жизнедеятельности клетки. В клеточных мембранах локализованы высокочувствительные рецепторы, с помощью которых клетки распознают и отрабатывают сигналы, поступающие из окружающей среды, дифференцируют питательные вещества и различные антибактериальные соединения. На поверхности цитоплазматической мембраны содержатся активные ферментные системы (пер-меазы), принимающие участие в синтезе белка, ферментов, нуклеиновых кислот. Цитоплазматическая мембрана образует лизосомы, участвующие в делении клетки.
# Клеточная стенка защищает бактерии от вредных факторов внешней среды, принимает участие в росте и делении клетки. Прочность стенки обеспечивает му-реин, вещество полисахаридной природы. Некоторые вещества, например, лизоцим, могут разрушать клеточную стенку. Бактерии, полностью лишенные клеточной стенки, называются «протопластами», они имеют шаровидную форму, обладают способностью к дыханию, синтезу белков, нуклеиновых кислот, ферментов, спорообразованию. Сохранить протопласты можно только в гипертонических растворах.
Рис. 1. Строение бактериальной клетки
1 — капсула; 2 — клеточная стенка; 3 — цитоплазмати-ческая мембрана; 4 — спора; 5— цитоплазма; 6 — ядерное вещество; 7 — ли-зосомы; 8 — рибосомы; 9 — жгутик; 10— пили
* Капсула. Под влиянием различных факторов среды некоторые микробы обладают способностью откладывать на поверхности своего тела более мощный слизистый слой вокруг клеточной стенки, получивший название «капсулы».
Капсульное вещество бактерии состоит из полисахаридов, мукополисахаридов или полисахаридов. Капсулообра-зование считается приспособительной функцией микроба. Патогенные капсульные микробы (клебсиеллы, возбудители сибирской язвы, возбудители пневмонии) более устойчивы к фагоцитозу, действию защитных факторов организма и внешней среды.
« Жгутики являются основным локомоторным органоидом бактерий. В результате их энергичного движения, напоминающего вращение штопора, жидкость движется вдоль жгутиков и бактерий и развивает скорость « 50 мкмс. Жгутики состоят из белковых веществ типа флагеллина, принадлежащего к классу сократимых белков.
Жгутики связаны с телом бактериальной клетки при помощи двух дисков: наружный находится в клеточной стенке, внутренний — в цитоплазматической мембране. По расположению жгутиков подвижные микробы подразделяются на 4 группы:
1. Монотрихи — бактерии с одним жгутиком на конце (холерный вибрион, синегнойная палочка).
2. Амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах (Spimliun volutans).
3. Лофотрихи — бактерии, которые имеют по пучку жгутиков на одном конце (палочки сине-зеленого молока).
4. Перитрихи — бактерии, обладающие жгутиками по всей поверхности тела (Е. coli, сальмонеллы брюшного тифа, паратифов А и В).
У некоторых видов микробов имеются пили (реснички, фимбрии, филаменты), представляющие собой образования, которые значительно короче и тоньше жгутиков. Они покрывают тело клетки. Полагают, что они не являются органами передвижения, а способствуют прикреплению микробных клеток к поверхности некоторых субстратов.
Споры и спорообразование. Спорообразование присуще некоторым, преимущественно палочковидным микроорганизмам (бациллы и клостридии). При попадании бацилл в неблагоприятные условия в клетке возникают структурные изменения. В одном из участков клетки цитоплазма с частью нуклеоида уплотняется, образуется предспоровая мембрана; затем она покрывается плотной многослойной мембраной, содержащей минимальное количество свободной воды и большое количество кальция, липидов и миколовой кислоты.
Споры обладают повышенной устойчивостью к действию факторов внешней среды и могут длительно (десятки лет) сохраняться в неблагоприятных условиях. Споры некоторых бацилл выдерживают кипячение и действие высоких концентраций дезинфицирующих средств.
Спорообразование происходит у бактерий в течение 18— 20 часов. В бактериальной клетке образуется только одна спора, из нее прорастает только одна вегетативная клетка, следовательно, спора не является органом размножения, а служит только для перенесения неблагоприятных условий.
По характеру локализации в теле бацилл и клостридий споры располагаются:
1) центрально — возбудитель сибирской язвы;
2) субтерминально — ближе к концу (возбудитель ботулизма, анаэробной инфекции и др.);
3) терминально — на конце палочки (возбудитель столбняка).
Кроме бактерий заболевания могут вызывать и другие организмы: риккетсии, вирусы, актиномицеты, простейшие.
Вирусы представляют собой особую группу неклеточных форм жизни, обладающих собственным геном, способным к воспроизведению в клетках всех видов организмов. Они являются облигатными (обязательными) внутриклеточными паразитами человека, животных, насекомых, грибов, растений и бактерий. Вирусы подразделяются на 2 группы:
1. ДНК-содержащие (вирус натуральной оспы и вирус простого герпеса человека, аденовирусы);
2. РЫК-содержащие (вирус гриппа, парагриппа, бешенства, вирус везикулярного полиомиелита, стоматита Нью-Джерси и др.).
Вирусная частица носит название «вирион». Он состоит из центрально расположенной нуклеиновой кислоты РНК или ДНК, окруженного одной или двумя оболочками.
Первая оболочка, в которой заключена нуклеиновая кнЙс лота, называется капсид (от греч. konca — ящик).
Размножение вирусов осуществляется путем раздельного синтеза оболочки и нуклеиновой кислоты в клетке хозяина с последующей сборкой вирионов. Этот процесс получил название «репродукции».
Форма вирионов разнообразна: сферическая палочковидная, кубоидальная и сперматозоидная, пулевидная.
Среди вирусов выделяют особую группу фагов (от лат. phages — пожирающий), вызывающих лизис (разрушение) клеток микроорганизмов (бактерий). Они не вызывают заболеваний человека и животных. В лабораториях вирусы культивируются в курином эмбрионе, организме животных или культуре ткани.
Микоплазмы — это микроорганизмы, лишенные клеточной стенки, но окруженные трехслойной липопротеидной ци-топлазматической мембраной. Микоплазмы обнаружены в почве, сточных водах, на различных субстратах, в организме животных и человека. Имеются патогенные и непатогенные виды.
К патогенным для человека относится Mycoplasma pneumonia, к полупатогенным — m. hominy's и Т- группа.
Клетки микоплазм весьма полиморфны (шаровидные, кольцевидные, коккобациллярные, нитевидные, ветвистые, в виде элементарных телец). Патогенные микоплазмы поражают органы дыхания, мочеполовую и ЦНС. В настоящее время этим возбудителям уделяется особое внимание как возбудителям заболевания воспалительного характера.
Спирохеты (от лат. speira — изгиб, chaite — волосы) — бактерии, имеющие штопорообразную извитую форму. Размеры их колеблются в больших пределах (ширина — 0,3— 1,5 мкм, длина— 7—500 мкм). Тело спирохет состоит из осевой нити (пучок фибрилл) и цитоплазмы, спирально завитой вокруг нити. Спирохеты передвигаются путем сокращения внутренней, осевой нити; спор, капсул и жгутиков не образуют.
В семейство sperochetaceae входят как непатогенные (обитатели водоемов), так и патогенные бактерии. К патогенным относятся 3 рода: Treponema, Zeptoapara, Borrelia.
Treponema pallidum — возбудитель сифилиса. Под влиянием факторов внешней среды и лечебных препаратов тре-понемы в ряде случаев свертываются в клубки, образуя цисты, покрытые непроницаемой муциноподобной оболочкой. Они длительное время могут находиться в организме больного в латентном состоянии; при благоприятных условиях цисты превращаются в зерна, а затем в типичные спиралевидные трепонемы.
Риккетсии — это полиморфные микроорганизмы, которые живут и размножаются только в клетках тканей животных, человека и переносчиков. Они не образуют спор и капсул, неподвижны. Большая часть риккетсий относится к безвредным микроорганизмам. Около 50 различных видов риккетсий найдено в кишечнике и слюнных железах тлей, клопов, клещей. Патогенные риккетсий поражают различных животных и человека. Заболевания, вызываемые риккетсия-ми, носят название «риккетсиозов» (эпидемический сыпной тиф, различные лихорадки: пятнистая, марсельская и др.).
Хламидии — облигатные внутриклеточные бактерии кок-ковидной формы; размножаются только в цитоплазме клеток позвоночных. К роду Chlamydia принадлежат возбудители трахомы, конъюнктивитов, пахового лимфогранулематоза, орнитоза.
Возбудитель Chlamydia treachealis паразитирует в цитоплазме эпителиальных клеток конъюнктивы и роговой оболочки глаза.
Конъюнктивит новорожденных, или бленнорея, протекает с явлениями инфильтрации конъюнктивы, особенно нижнего века. Источником заражения являются матери, у которых возбудитель сохраняется в мочеполовой системе и передается во время родов новорожденным детям. Взрослые заражаются при купании в небольших прудах и нехлорированных бассейнах. Заболевание у них проявляется в виде острого фолликулярного конъюнктивита и продолжается около года.
Простейшие — одноклеточные эукариотные животные организмы, более высоко организованные по сравнению с бактериями. Они имеют цитоплазму, дифференцированное ядро, оболочку, примитивные органоиды.
Простейшие размножаются простым и множественным делением, половым путем.
Тип Protozoa насчитывает свыше 30 тыс. видов и подразделяется на:
1) жгутиковые;
2) саркозовые; 3)споровики;
4) ресничные.
К патогенным простейшим относятся возбудители лей-команиоза, трипаносоза, трихомониаза, лямблиоза, амебио-за, малярии, токсоплазмоза, балантидиаза.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ Устройство микроскопа
1. Оптическая часть: окуляр, объектив, конденсор Аббе, осветительный прибор (зеркальце).
2. Механическая часть: штатив, подставка, предметный столик, тубус, тубу-содержатель, макровинт, микровинт. Увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра.
Все микробиологические исследования по выявлению и идентификации микроорганизмов осуществляются в научно-исследовательских институтах и бактериологических лабораториях центров Госсанэпиднадзора.
Для обеспечения требований безопасности при работе с микроорганизмами III—IV групп патогенности (см. приложения 7.1) и поточности продвижения потенциально инфицированного материала в бактериологической лаборатории выделяют «чистую» и «заразную» зоны.
В состав бактериологической лаборатории входят:
регистратура (приемная) — производится прием и регистрация поступившего для исследования материала, дается номер отобранной пробе;
* средоварная — приготовление питательных сред из сухих;
* препараторская — подготовка лабораторной посуды, ватно-марлевых пробок, тампонов и т. д.;
* стерилизационные — стерилизация питательных сред, растворов, посуды;
* «заразные» стерилизационные — служат для обеззараживания патологического материала; посевная — производится первичный посев материала на питательные среды;
* лабораторные комнаты — служат для исследований на капельную, кишечную группы бактерий, для санитар-но-бактериологических исследований. Лабораторное помещение оборудуется столами лабораторного типа, шкафами и полками для хранения необходимой при работе аппаратуры, посуды, красок и реактивов.
Приложение 7.1 (обязательное)
Санитарные правила СП 1.2.731-99
Классификация патогенных для человека микроорганизмов
III и IV групп патогенности (извлечение из приложения 5.1 к
СП 1.2.011-94)
Бактерии III группа
1. Bordetella pertussis
2. Borrelia recurrentis
3. Campylobacter fetys
4. Campylobacter jejuni
5. Clostridium botulinium
6. Clostridium tetani
7. Corynebacterium diphteriae
8. Erysipelothrix rhusiopathiae
9. Helicobacter pylori
10. Leptospira interrogans
11. Listeria monocytogenes
12. Mycobacterium leprae
13. Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium avium коклюша возвратного тифа абсцессов, септецимий энтерита, холецистита ботулизма столбняка дифтерии эризепелоида гастрита, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки лептоспироза листериоза проказы туберкулеза
14. Neisseria gonorrhoeae
15. Neisseria meningitidis
16. Nocarolia asteroides
17. Proactinomyces israelii
18. Salmonella paratyphi A
19. Salmonella paratyphi В
20. Salmonella typhi
21. Shigellaspp.
22. Treponema pallidum
23. Yercinia pseudotuberculosis
24. Vibrio cholerae 01
IV группа
1. Aerobacter aerogenes
2. Bacillus cereus
3. Bacteroides spp.
4. Borrelia spp.
5. Bordetella bronchiseptica
Bordetella parapertussis
6. Campylobacter spp.
7. Citrobacter
8. Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridium bifermentans
9. E. coli
10. Eubacterium endocarditidis
11. Eubacterium lentum Eubacterium ventricosum гонореи менингита нокардиоза актиномикоза паратифа А паратифа В брюшного тифа дизентерии сифилиса псевдотуберкулеза нетоксигенной диареи энтерита пищевой токсикоин-фекции абсцессов легких, бактериемии клещевого спирохетоза бронхосептикоза паракоклюша гастроэнтерита, гингивита, периодонтита местных воспалительных процессов, пищевой токсикоинфекции газовой гангрены энтерита септического эндокардита вторичных септеце-мий, абсцессов
12. Flavobacterium meningoseptium
13. Haemophilus influenza
14. Hafnia alvei
15. Klebsiella ozaenae
16. Klebsiella pneumoniae
17. Klebsiella rhinoscleromatis
18. Mycobacterium spp. Photochromogens Scotochromogens Nonphotochromogens Rapid growers
19. Micoplasma hominis 1
Micoplasma hominis 2 Micoplasma pneumoniae
20. Propionibacterium avidum
21. Proteus spp.
22. Pseudomonas aeruginosa
23. Salmonella spp.
24. Serratia marcescens
25. Staphilococcus spp.
26. Streptococcus spp.
менингита, септецемий менингита, пневмонии, ларингита холецистита, цистита озены пневмонии риносклеромы микробактериозов местных воспалительных процессов, пневмонии сепсиса, абсцессов пищевой токсикоинфекции, местных воспалительных процессов местных воспалительных процессов, сепсиса сальмонеллезов местных воспалительных процессов, сепсиса пищевой токсикоинфекции, септецемий, пневмонии пневмонии, тонзиллита, полиартрита, септецемий энтерита, колита актиномикоза
27. Yersinia enterocolitica
28. Actinomyces albus
Для того чтобы увидеть микроорганизмы, их необходимо окрасить. Существуют простые и сложные способы окра- шивания микроорганизмов. При простом способе окрашивания на мазок наносится один краситель, при сложном способе окрашивания — 2 или более красителей. К таким способам окрашивания относится окраска по Граму. Соответственно выделяют формы бактерий грамположительные (окрашиваются в фиолетовый цвет) и грамотрицательные (окрашиваются в красный цвет). Грамположительные бактерии имеют несложно организованную, но мощную клеточную стенку, состоящую из множественных слоев пептидоглика-на, включающих уникальные полимеры тейхоевых кислот. Грамотрицательные бактерии имеют более тонкую клеточную стенку, включающую бимолекулярный слой пептидо-гликана и не содержащую тейхоевой кислоты.
Грам +
Грам -
Мембрана
Мукопептиды (муреины)
Мембрана
Лишшолисахариды и белки
Рис. 2. Схема строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов
Приготовление мазка из зубного налета
1. Небольшое количество зубного налета снять острым концом спички.
2. Растереть на предметном стекле размером с пятикопеечную монету.
3. Мазок зафиксировать путем трехкратного проведения над пламенем горелки.
4. Мазок окрасить по Граму.
5. Промыть водой.
6. Высушить фильтровальной бумагой и на воздухе.
7. Микроскопировать.
Окраска препарата по Граму
1. Небольшое количество генцианвиолета напить на препарат; время окраски — 2 мин.
2. Избыток краски слить в лоток, на препарат нанести пипеткой несколько капель раствора Люголя на 1 минуту.
3. На препарат налить несколько капель спирта, обесцвечивание проводить до отхождения фиолетовых капель — струи краски, но не более 30 с.
4. Мазок тщательно промыть водой.
5. Мазок докрасить разведенным фуксином — 2 мин.
Микроскопирование препарата
1. Установить освещение: конденсор должен быть поднят до упора, настройку производить с объективом малого увеличения 8-х — необходимо белое освещенное поле.
2. Препарат поместить на предметный столик.
3. Макровинтом опустить объектив на расстояние 0,5 см от препарата.
4. Глядя в окуляр, получить изображение препарата, вращая макровинт против часовой стрелки (на себя).
5. Произвести точную фокусировку с помощью микровинта.
6. Переместить револьвер на большое увеличение (объектив 40-х) и провести дефокусировку только микровинтом.
7. После просмотра препарата перевести револьвер на увеличение 8-х (малое) и только после этого снять препарат с предметного столика.
Кроме окраски по Граму к сложным дифференциальным методам окраски относятся:
1. Окраска кислотоустойчивых бактерий по Цилю— Нильсену фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают 3—5 мин раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краску до кипения;
* дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток краски, препарат промывают водой;
* окрашенный препарат обесцвечивают 5% H2SO4 (серной кислотой) в течение 3—5 с или 96° этиловым спиртом, содержащим 3% по объему соляной кислоты, несколько раз погружая в стаканчик с раствором;
* после обесцвечивания остаток кислоты сливают, препарат промывают водой;
* докрашивают дополнительно метиленовой синью Леф-флера 3—5 мин, промывают водой, подсушивают и микроскопируют.
Результаты окраски: при окраске препаратов по методу Циля—Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в красный цвет.
2. Окраска по Романовскому—Гимзе
Краска Романовского—Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды прибавляют 10 капель краски Романовского—Гимзы. Приготовленный раствор краски наносят на фиксированный мазок и оставляют на 1 ч. Затем краску сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Краска Романовского—Гимзе окрашивает микробы в фиолетово-красный цвет.