Выделение ДНК из биоматериалов.

Принцип метода.

Протеинолиз протеиназой К с последующей фенол-хлороформной экстракцией белков и дальнейшим осаждением ДНК 96% этанолом.

Ход работы.

4.2.1 Депротеинизация.

- К препарату добавить 250мкл 5Хбуфера для протеиназы К до 1Х (10 мМ трис-HCl рН 8,0, 5 мМ ЭДТА рН 8,0, 0,5% SDS), ресуспендировать.

- Протеиназу К добавить из расчета 500мкг на 1 мл конечного объема.

- Инкубировать при 56С 8 часов.

Приготовление растворов:

- Приготовление раствора протеиназы К.

1мл глицерина

1мкл 2М CaCl₂

20мкл 1М TrisHCl рН8

970мкл ddН₂О.

Развести в этом буфере 100мг Протеиназы К (50мкг/мкл).

Хранить -20^оС, 2 месяца.

Приготовление рабочего раствора 5хбуфера для протеиназыК

Исходный реактив	Кол-во в мкл	Конечная концентрация
1М TrisHCl рН8		50мМ
0,5М ЭДТА рН8		25мМ
10% SDS		2,5%
ddН₂О	Довести до 10мл

Хранить при комнатной температуре, 1 месяц.

- Приготовление 500мл 1М TrisHCl рН8

Tris 60,55г , довести ddН₂О до 450мл

Титровать 3М HCl до рН 8,0.

Довести водой до 500мл.

Хранить +4^оС, 3 месяца.

Приготовление 500мл 0,5М ЭДТА рН8

ЭДТА 93,05г, довести ddН₂О до 400мл

Титровать NaOH до рН 8,0.

Довести водой до 500мл.

Хранить +4^оС, 3 месяца.

4.2.2 Выделение ДНК.

- К продуктам протеинолиза добавить равный объем водного фенола с pH 8,3, ресуспендировать и центрифугировать при ускорении 4500 g , в течение 15 минут, при температуре 4ºС. Отобрать супернатант в чистую пробирку.

- Добавить к супернатанту равный объем смеси фенол-хлороформ 10:1. Ресуспендировать и центрифугировать при ускорении 4500 g , в течение 15 минут, при температуре 4ºС. Отобрать супернатант в чистую пробирку.

- Добавить к супернатанту равный объем хлороформа (24:1 хлороформ : изоамиловый спирт). Ресуспендировать и центрифугировать при ускорении 4500 g , в течение 15 минут, при температуре 4ºС. Отобрать супернатант в чистую пробирку.

- Добавить к супернатанту водный раствор гликогена (10 мг/мл) из расчета 3 мкл на 1 мл супернатанта. Ресуспендировать, добавить 10М ацетат аммония до 2М (1 объем/4 объемам), ресуспендировать и добавить 2,5 объема 96% этанола. Ресуспендировать.

- Инкубировать 120 мин при -20ºС.

- Центрифугировать при ускорении 4500 g , в течение 80 минут, при температуре 4ºС.

- Декантировать, добавить к пробе 1 мл 70% этанола, центрифугировать при ускорении 4500 g , в течение 10 минут, при температуре 4ºС.

- Декантировать. Осадок ДНК сушить 10 часов в ламинарном боксе.

- Растворить осадок в 50 мкл 1Х ТЕ-буфера (50 мМ трис-НСl pH 8,0, 10 мМ ЭДТА pH 8,0).

- Инкубировать 20 минут при 56ºС, аккуратнно перемешать пипетированием а развести до рабочей концентрации (4мкл раствора ДНК+96 мкл 1Х ТЕ-буфера).

Приготовление растворов:

- Приготовление 400мл водного фенола.

Приготовить буфер для насыщения фенола (400мл 10мМ ЭДТА, 50мМ TrisHCl)

8мл 0,5М ЭДТА рН8

20мл 1М TrisHCl рН8

довести водой до 400мл.

Расплавить 400мл фенола при температуре 56^оС на водяной бане.

Добавить 400мл буфера к 400мл расплавленного фенола с 8-оксихинолином (0,4г) при постоянном перемешивании на магнитной мешалке.

Перемешивать в течении 8 часов при комнатной температуре.

Отстаивать 12 часов при 4^оС.

Слить буфер, оставив его над фенолом примерно на 1см.

Хранить +4^оС, 3 месяца.

- Приготовление ТЕ

30 мкл 0,5М ЭДТА рН8

150мкл 1М TrisHCl рН8

довести Н₂О до 15мл.

Хранить при комнатной температуре, 1 месяц.

4.2.3 Количественное определение ДНК.

Принцип метода:

Определение проводят методом спектрофлуориметрии.

Оборудование:

- Спектрофлуориметр Qubit (Invitrogen – Life Technologies);

- Вортекс для пробирок объемом 0,5 мл;

- Микроцентрифуга для пробирок объемом 0,5 мл;

Реактивы:

- 10-кратный HS-Буфер для определения концентрации двухцепочечной ДНК (Invitrogen – Life Technologies);

- Вода бидистиллированная деионизованная (Milli-Q);

- Стандартный образец для калибровки спектрофлуориметра с концентрацией двухцепочечной ДНК 100 нг/мкл (Invitrogen – Life Technologies);

- Стандартный образец для калибровки спектрофлуориметра, не содержащий двухцепочечной ДНК (Invitrogen – Life Technologies).

Приготовление растворов:

1-кратный HS-Буфер для определения концентрации двухцепочечной ДНК

1 мл 10-кратного HS-Буфера для определения концентрации двухцепочечной ДНК вносят в пробирку вместимостью 15-20 мл. Добавляют 9 мл бидистиллированной деионизованной воды и тщательно перемешивают. 1-кратный HS-буфер может храниться до полугода при + 4° С в защищенном от света месте.

Рабочий раствор контрольного образца ДНК:

190 мкл 1-кратного HS-Буфера для определения концентрации двухцепочечной ДНК вносят в пробирку для ПЦР полипропиленовую ультрапрозрачную объемом 0,5 мл. Туда же вносят 10 мкл положительного контрольного образца ДНК. Закрывают пробирку, содержимое перемешивают в течение 1 мин на вортексе, сбрасывают капли на микроцентрифуге.

Рабочий раствор стандартного образца для калибровки спектрофлуориметра с концентрацией двухцепочечной ДНК 100 нг/мкл:

190 мкл 1-кратного HS-Буфера для определения концентрации двухцепочечной ДНК вносят в пробирку для ПЦР полипропиленовую ультрапрозрачную объемом 0,5 мл. Туда же вносят 10 мкл стандартного образца для калибровки спектрофлуориметра с концентрацией двухцепочечной ДНК 100 нг/мкл. Закрывают пробирку, содержимое перемешивают в течение 1 мин на вортексе, сбрасывают капли на микроцентрифуге.

Рабочий раствор стандартного образца для калибровки спектрофлуориметра, не содержащего двухцепочечной ДНК:

190 мкл 1-кратного HS-Буфера для определения концентрации двухцепочечной ДНК вносят в пробирку для ПЦР полипропиленовую ультрапрозрачную объемом 0,5 мл. Туда же вносят 10 мкл стандартного образца для калибровки спектрофлуориметра, не содержащего двухцепочечной ДНК. Закрывают пробирку, содержимое перемешивают в течение 1 мин на вортексе, сбрасывают капли на микроцентрифуге.

Процедура:

Концентрацию ДНК в испытуемом образце измеряют с помощью спектрофлуориметра Qubit в соответствии с инструкцией производителя. Усредняют результаты трех измерений. Для проведения повторных измерений в одном и том же образце после каждого измерения пробирку с испытуемым образцом вынимают из спектрофлуориметра и оставляют при температуре 25-30° С в защищенном от света месте на 1-2 мин во избежание искажения данных в связи с нагреванием образца во время измерения. По результатам измерений разводят ДНК в буфере ТЕ до конечной концентрации 30 нг/мкл.

5. ТП2 (Полимеразная цепная реакция):

Полимеразная цепная реакция анализируемой последовательности 7-го экзона гена IRF6.

Принцип метода.

Амплификация (наработка) анализируемой последовательности.

Ход работы.

Приготовление реакционной смеси для амплификации.

ПЦР проводили в 25 μl реакционной смеси, для чего готовили премикс следующего состава:

10х реакционный буфер для ПЦР (Хеликон) 2,5 μl ;

5 ρМ каждого праймера (ЗАО «Синтол» Паспорт №2201 от 21.01.2010) 1 μl;

5 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (dNTP, кат №R1121, Fermentas) 1 μl;

25 мМ MgCl₂ (ЗАО «Синтол» кат №005-08070901) 2,5 μl ;

2,5 ед. акт. термостабильной ДНК-полимеразы (Taq-полимераза Thermostar (Хеликон));

до 22 μl Н₂О;

В премикс (22 мкл) добавить 3 мкл матрицы ДНК, ресуспендировать на Vortex, сбросить и поставить в амплификатор (программируемый термоциклер производства фирмы «Applied Biosistems»).

Последовательность праймеров и условия амплификации

Амплифицируемый участок	Последовательность праймеров 5¢® 3¢	Длина Фрагмента (п.н.)	t° отжига

Амплификация проводится в следующем режиме:

активация полимеразы 95ºС, 15 мин;

Температура отжига 60ºС 45 секунд

Температура элонгации 72ºС 40 секунд

Температура плавления 95ºС 1 минута 20 секунд

35 циклов

конечный отжиг 60ºС, 3 мин;

конечная элонгация 72ºС, 5 мин.

Нуклеотидная последовательность ДНК амплифицированного фрагмента:

Приборы и реактивы, используемые в работе

Приборы:

Программируемый термоциклер производства фирмы Applied Biosistems.

Вортекс Biosan

Реактивы:

10х реакционный буфер для ПЦР 10 мл (Хеликон);

25 мМ MgCl₂ 5 μl (ЗАО «Синтол» кат №005-08070901);

Праймеры (ЗАО «Синтол» Паспорт №2201 от 21.01.2010);

смесь dNTP 25 мМ (кат №R1121, Fermentas);

термостабильная ДНК-полимеразы (Taq-полимераза) Thermostar (Хеликон);

6 ТП3 (Проверка качества полученного ПЦР-продукта методом электрофореза в 8% ПААГ):

6.1 Приготовление 8% ПААГ.

Ход работы.

Приготовить 8% полиакриламидный гель (ПААГ) для электрофореза.

Последовательность приготовления 8% геля:

6,6 мл 30% акриламида (29:1)

2,5 мл 10хТВЕ буфера (89 mM трис-борат, 89 mM борная кислота, 2 mM ЭДТА)

Довести ddН₂О до 25 мл.

Непосредственно перед заливкой геля в раствор добавить 200 ml 10%-го ПСА (Sigma, Molecular Biology Grade) и 12ml ТЕМЕД (Sigma, Molecular Biology Grade) для полимеризации геля.

Перемешать с помощью лопатки и гель залить между стеклами, разделёнными спейсерами, не допуская образования пузырей, задвинуть гребенку. Гель полимеризуется около 30 минут. После высыхания, закрепить стекла на камере и убрать гребенку.

6.2 Нанесение ПЦР-продуктов и электрофорез.

- Залить 1хTBE в камеру, промыть лунки и подключить электроды к камере.

- Провести преэлектрофорез (сила тока – 15мА, время 15 минут).

- Нанести смешанные с индикаторной краской образцы в лунки.

- Электрофорез провести при силе тока 20мА и напряжении 160 вольт до выхода красителя бромфенолового синего.

6.3 Окраска геля раствором бромистого этидия

- Для визуализации результата в ультрафиолетовом свете, гель красить раствором бромистого этидия (конечной концентрации 0,7 мкг/мл).

Приготовление растворов:

- Приготовление 10ХТВЕ рН 8,3-8,4. (трисборатный буфер для электрофореза)

Tris -108г.

Борная кислота – 55г.

0,5М ЭДТА рН 8 – 40мл

ddН₂О до 1000мл Хранение: при комнатной температуре, 2 месяца

- Приготовление 30% акриламида (29:1)

АА (акриламид) – 145г

бисАА (бисАкриламид) – 5г

ddН₂О до 500мл, фильтровать. Хранение: +4^оС, 3 месяца

- Приготовление 10% PSA

PSA – 0,3г

Н₂О – 2,7мл Хранение: +4^оС, 14 дней

- Приготовление краски для электрофореза.

Бромфеноловый синий – 0,25% (Sigma, Molecular Biology Grade)

Ксиленцианол – 0,25% (Sigma, Molecular Biology Grade)

Глицерин 40%

Довести Н₂О Хранение: при комнатной температуре, 6 месяцев

- Бромистый Этидий

10 мг/мл (Sigma, Molecular Biology Grade) Хранение: +4^оС, 6 месяцев

Приборы и реактивы, используемые в работе

- Приборы:

Камера для электрофореза с набором стекол Helicon V-I

Источник питания Эльф-4 (ДНК-технология)

Трансиллюминатор и видеосистема BioRad

- Реактивы:

Трис основной (2-Амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол, кат.№ T6791-5KG, Sigma)

ЭДТА (кат.№ A-1103,0500, AppliChem)

Борная кислота (кат.№ 141015.1210, Panreac)

Акриламид (кат.№ A-1089,0500, AppliChem)

N,N'-Метилен-бис-акриламид (кат.№ M7279, Sigma)

PSA Sigma, Molecular Biology Grade

Бромфеноловый синий Sigma, Molecular Biology Grade

Ксиленцианол Sigma, Molecular Biology Grade

Глицерин (кат.№ 141339.1211, Panreac)

Бромистый Этидий Sigma, Molecular Biology Grade

ТЕМЕД Sigma, Molecular Biology Grade

7. ТП4 (SSCP- электрофорез продуктов амплификации в 12% ПААГ с окрашиванием раствором нитрата серебра).

Принцип метода.

Расхождение однонитевых фрагментов амплифицированной ДНК в полиакриламидном геле под действием силы тока в соответствии с конформацией однонитевой ДНК.

7.1 Приготовление 12% ПААГ

Ход работы.

Последовательность приготовления 12% геля:

- 10 мл 30% акриламида (акриламид : бисакриламид = 29 : 1)

- 2,5 мл 10хТВЕ буфера pH 8.3

- Довести ddН2О до 25 мл.

- Непосредственно перед заливкой геля в раствор добавить 200 ml 10%-го ПСА (Sigma, Molecular Biology Grade) и 12ml ТЕМЕД (Sigma, Molecular Biology Grade) для полимеризации геля.

- Потом перемешать с помощью лопатки и гель залить между стеклами, разделёнными спейсерами, не допуская образования пузырей, задвинуть гребенку. Гель полимеризуется около 30 минут. После высыхания, закрепить стекла на камере и убрать гребенку.

7.2 Нанесение ПЦР-продуктов и электрофорез.

- Залить 1хTBE в камеру, промыть лунки и подключить электроды к камере.

- Провести преэлектрофорез (напряжение 230 вольт, время 20 минут).

- Подготовить пробы для нанесения в гель. Смесь 7 мкл продукта ПЦР и 7 мкл денатурирующего раствора, инкубировать 5 минут при температуре 99°С, после прогревания пробы немедленно поместить в лед на 3 минуты и затем внести в ПААГ.

- Электрофорез провести в вертикальном приборе в однократном ТВЕ-буфере при постоянном напряжении тока. (напряжение 230 вольт, время 1 час, далее напряжение 260 вольт, время 2 часа и напряжение 230 вольт, время 2 часа при температуре +20оС)

- По окончании программы электрофореза снять гель с камеры и начать окрашивание нитратом серебра.

7.2 Окраска геля раствором нитрата серебра

Этапы окраски геля нитратом серебра:

- Залить гель 0,1% раствором AgNO3 и поставить на шейкер на 10 минут.

- Промыть 1 минуту ddH2O.

- Залить проявителем.

- Держать на шейкере, до получения нужного результата окрашивания, слить проявитель и быстро залить 10% бидистиллированной водой. Поставить на шейкер на 2 минуты.

- Для получения изображения в электронном виде гель сфотографировать гель на системе регистрации BioRad

Приготовление растворов:

Приготовление 10ХТВЕ рН 8,3-8,4. (трисборатный буфер для электрофореза)

- Tris -108г.

- Борная кислота – 55г.

- 0,5М ЭДТА рН 8 – 40мл

- ddН2О до 1000мл Хранение: при комнатной температуре, 2 месяца

Приготовление 30% акриламида (29:1)

- АА (акриламид) – 145г

- бисАА (бисАкриламид) – 5г

- ddН2О до 500мл, фильтровать. Хранение: +4оС, 3 месяца

Приготовление 10% PSA